Avaliação da imunogenicidade de diferentes fragmentos da vacina pCDNA3-hsp65

Autor(es)

Claudia Andréa Alves de Araújo

• Tipo de documento: Dissertação de Mestrado
• Imprenta: Ribeirão Preto.
• Instituição: Universidade de São Paulo (USP). Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (PCARP/BC)
• Data de defesa: 2002-12-19

Membros da banca

Celio Lopes Silva; Marcelo Brocchi; Luciana Cezar de Cerqueira Leite

• Orientador: Celio Lopes Silva

Resumo

Tem sido recentemente demonstrado que a vacina pCDNA3-hsp65 apresenta atividade profilática e terapêutica na tuberculose experimental. Essa vacina é constituída do gene hsp65 Mycobacterium leprae e fragmento downstream de 1324 pb. Entretanto, uma investigação mais refinada da resposta imune desencadeada por diferentes fragmentos do inserto dessa vacina ainda não foi realizada. Também, não foi estudada, a influência do fragmento downstream ao gene hsp65 na indução da resposta imune pela vacina. Para tal propósito, foram construídos subclones da vacina pCDNA3-hsp65, com a colaboração da Dra. Sylvia Cardoso Leão (UNIFESP), para utilização nos esquemas de imunização e nos ensaios para avaliar a resposta imune humoral e celular. As novas construções de DNA foram denominadas pCDNA3-hsp65G (G = gene hsp65, para diferenciar da construção vacinai original, que contém gene hsp65 + fragmento downstream), pCDNA3-N (N = N-terminal da proteína Hsp65), pCDNA3-N59 (N59 = 59 pb codificante da extremidade N-terminal da Hsp65) e pCDNA3-DS (DS = downstream). Camundongos BALB/c foram imunizados por via intradérmica (Gene Gun) ou via intramuscular, com 10 µg/dose ou 100 µg/dose, respectivamente. Foram feitas três imunizações com intervalo de 15 dias entre elas; 30 dias após a 3a imunização, os animais foram sacrificados e a resposta imune foi avaliada. A resposta imune humoral foi avaliada pelos títulos de anticorpos IgG, lgG1 e lgG2a anti-Hsp65 através de ELISA. A resposta imune celular foi avaliada utilizando três parâmetros: proliferação de células totais do baço e linfonodos inguinais por incorporação de timidina triciada, produção das citocinas IL-4, IL-10, IFN-gama e IL-12 Hsp65-específicas por ELISA e determinação do influxo de linfócitos B, linfócitos T CD4+ e CD8+, macrófagos e células dendríticas para o baço dos animais imunizados com as construções de DNA. Por via intradérmica (Gene Gun), as imunizações com as construções a construção vacinai original pCDNA3-hsp65 e pCDNA3-hsp65G, construção contendo somente o gene hsp65 de Mycobacterium leprae, induziram elevados níveis de anticorpos IgG, lgG1 e lgG2a anti-Hsp65. Essas construções também induziram resposta imune celular específica. Células totais do baço e linfonodos inguinais dos animais imunizados com pCDNA3-hsp65 e pCDNA3-hsp65G proliferaram significativamente na presença de Hsp65 recombinante. A produção das citocinas IL-10, IFN-gama e IL-12 antígeno específica foi elevada, caracterizando um perfil misto Th1/Th2, porém com tendência a resposta Th2. Esse dado corroborou com os elevados títulos de anticorpos lgG1 e lgG2a. Também verificou-se um aumento no influxo de macrófagos, células dendríticas, linfócitos B, linfócitos T CD4+ e T CD8+ no baço dos animais imunizados em relação aos grupos controles (pCDNA3 e não imunizado). Entretanto, a resposta imune humoral e celular desencadeada pela construção vacinai original pCDNA3- hsp65 foi maior que aquela induzida por pCDNA3-hsp65G. As construções pCDNA3-N, pCDNA3-DS e pCDNA3-N59 não induziram resposta imune específica. Por via intramuscular, as construções pCDNA3-hsp65, pCDNA3-hsp65G e pCDNA3-N induziram elevados títulos de IgG, lgG1 e lgG2a anti-Hsp65, proliferação celular e produção significativa das citocinas avaliadas e aumento do influxo de macrófagos, células dendríticas, linfócitos B, linfócitos T CD4+ e CD8+ em comparação com os controles (pCDNA3 e não imunizado). Um perfil Th1 de resposta é induzido por pCDNA3-hsp65, pCDNA3-hsp65G e pCDNA3-N, quando injetadas por via intramuscular, uma vez que elevados níveis de IFN-gama e IL-12, além de elevados títulos de lgG2a, foram detectados. Entretanto, não foram verificadas diferenças na ativação da resposta imune humoral e celular quando as construções pCDNA3-hsp65 e pCDNA3-hsp65G foram comparadas. A construção pCDNA3-N desencadeou resposta imune em menor magnitude que as construções pCDNA3-hsp65 e pCDNA3-hsp65G. As demais construções (pCDNA3-N59 e pCDNA3-DS) não foram imunogênicas. Esses resultados indicaram que a ausência do fragmento downstream ao gene hsp65 interfere significativamente na ativação da resposta imune humoral e celular pela vacina, quando os animais foram imunizados por via intradérmica (Gene Gun) com pCDNA3-hsp65G, construção que não contém o fragmento downstream. Isso sugeriu que existe a provável participação de motifs CpG, presente no fragmento downstream, na indução da resposta imune, que foi significativamente diminuída quando esse fragmento foi retirado da construção de DNA pCDNA3-hsp65G. Por outro lado, por via intramuscular, o fragmento downstream parece não interferir no desencadeamento da resposta imune humoral e celular pela vacina. Essas diferenças na indução da resposta imune pelo fragmento downstream parecem estar diretamente relacionadas com a quantidade de DNA que é injetada nos animais e com a via de administração do DNA. (AU)

• Processo FAPESP: 00/09176-4 - Estudos sobre a imunogenicidade da proteína HSP65 de micobactérias
• Beneficiário: Claudia Andrea Alves de Araujo
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Mestrado