Acessando a regulação transcricional da formação de biofilme em Escherichia coli utilizando bibliotecas genômica e de promotores

Autor(es)

Ananda Sanches Medeiros

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: Ribeirão Preto.
• Instituição: Universidade de São Paulo (USP). Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (PCARP/BC)
• Data de defesa: 2023-05-31

Membros da banca

María Eugenia Guazzaroni; Regina Lúcia Baldini; Victor Sourjik

• Orientador: María Eugenia Guazzaroni

Resumo

Biofilmes são estruturas complexas formadas por comunidades bacterianas da mesma ou de espécies diferentes, embebidas em uma matriz extracelular composta por substâncias extracelulares poliméricas (EPS), como polissacarídeos, proteínas (como estruturas curli) e ácidos nucléicos. As redes reguladoras da formação do biofilme são compostas pela integração de estímulos ambientais e intracelulares. Uma de suas camadas é a regulação transcricional, que é capaz de alterar drasticamente a expressão gênica bacteriana, convertendo-a de um estilo de vida livre para um comportamento séssil. Para entender melhor como os genes relacionados ao biofilme são regulados por diferentes fatores de transcrição, decidimos aplicar a técnica de SortSeq para investigar a fundo a arquitetura de promotores centrais relacionados à formação de biofilme. Iniciamos este trabalho com 21 promotores, associados diretamente ao desenvolvimento do biofilme e motilidade bacteriana. Construímos e testamos uma biblioteca contendo esses 21 promotores mutados aleatoriamente a uma taxa de 10%. Os testes preliminares mostraram que esta biblioteca possuía muitas mutações e truncamentos das sequências promotoras, e poucas variantes, inviabilizando a aquisição de resultados com ela. Desta forma, decidimos focar em dois principais promotores de genes relacionados à síntese de curli: csgBAp e csgDp. Seus promotores estão restritos a uma mesma região intergênica e possuem uma relação estrita, uma vez que CsgD é um regulador mestre da transcrição do operon csgBA. Dividimos essa região intergênica em quatro partes e construímos bibliotecas com mutações focalizadas e aleatórias. Essas quatro bibliotecas foram inseridas individualmente nos promotores originais, os quais já haviam sido clonados em um plasmídeo de baixo número de cópias e modulam a expressão dos genes repórteres sfgfp e mCherry (plasmídeo csgBD-repórter). Para acessar como as mutações do promotor podem afetar a expressão de cada gene, transformamos as quatro bibliotecas na linhagem de E. coli W3110 RpoS+ e as cultivamos até a fase estacionária. Reproduzindo a técnica SortSeq, as culturas foram analisadas por citometria de fluxo e classificadas em quatro tubos de acordo com sua fluorescência para sfGFP, mCherry, sfGFP e mCherry, e negativo (sem expressão para ambos os repórteres). Triplicatas deste experimento tiveram seus plasmídeos extraídos e sequenciados usando a plataforma Illumina. Este novo design de biblioteca e abordagem SortSeq nos permitiu entender melhor como cada região promotora pode afetar a expressão de ambos os genes individual e conjuntamente, ajudando-nos a confirmar ou negar a atuação de sítios de ligação a fatores de transcrição já descritos. Também encontramos novos possíveis sítios de ligação para fatores de transcrição ainda não descritos, os quais foram utilizados para a predição de novos reguladores para esses promotores. Para expandir a investigação dos promotores csgBA e csgD construímos uma biblioteca genômica da cepa E. coli W3110 RpoS+, usando um plasmídeo contendo a transposase Tn5 e sequencias de DNA como código de barras. A transposase Tn5 presente no plasmídeo insere aleatoriamente um código de barras único em uma região única do DNA genômico. Em seguida, mapeamos o código de barras para sua região genômica correspondente, permitindo a identificação do sítio mutado apenas pelo sequenciamento do código de barras. Transformamos nosso plasmídeo csgBD-reporter (sem qualquer inserção de biblioteca) na biblioteca e usamos a abordagem SortSeq para dividir as bactérias nos mesmos quatro fenótipos e sequenciar o código de barras inserido por meio da técnica NGS. Esta segunda abordagem levou à identificação de novos atores na regulação gênica desses genes tão importantes associados à formação do biofilme. Combinando esses dois tipos de bibliotecas, descobrimos possíveis novas regulações dos promotores de csgBA e csgD que serão testados e confirmados futuramente. (AU)

• Processo FAPESP: 18/04810-0 - Desconstruindo a complexidade nas redes regulatórias de formação de biofilme em Escherichia coli
• Beneficiário: Ananda Sanches Medeiros
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado Direto