Mutação no gene Aire induzida pelo sistema CRISPR-Cas9 em modelo murino in vitro (células epiteliais medulares tímicas): impacto na adesão intercelular e na apresentação de antígeno

Autor(es)

Ana Carolina Monteleone Cassiano

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: Ribeirão Preto.
• Instituição: Universidade de São Paulo (USP). Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (PCARP/BC)
• Data de defesa: 2024-04-19

Membros da banca

Eduardo Antonio Donadi; Daniella Arêas Mendes da Cruz; Maria Danielma dos Santos dos Reis

• Orientador: Eduardo Antonio Donadi

Resumo

Além de controlar a expressão de antígenos de tecidos periféricos, o gene regulador autoimune (Aire) regula a expressão de genes de adesão em células epiteliais tímicas medulares (mTECs), processo essencial para a interação mTECtimócito. Para que esse processo ocorra, é importante que a arquitetura tridimensional (3D) do timo preserve a camada medular. Camundongos delidos de Aire têm medula tímica desorganizada, não existindo estudos sobre a interação mTEC-mTEC. Neste estudo, avaliamos a adesão mTEC-mTEC em modelo de cultura 3D de timo e o processo de apresentação de antígeno de mTEC do tipo selvagem (WT) e mTEC delida de Aire (E6) no domínio NLS. As células E6 foram obtidas utilizando CRISPR-Cas9. A adesão mTEC-mTEC foi avaliada em modelo in vitro para a formação de esferoides em 3D. Para o ensaio de apresentação de antígeno, utilizamos células WT e E6 estimulada com IFNγ em cocultura com células esplênicas T CD4+ naïve de animais OT II apresentando receptor específico para o peptídeo OVA323-339, na presença ou não de células dendríticas. A ausência de Aire: i) desorganiza a estrutura 3D dos esferoides de mTEC, ii) aumenta a proporção de células na fase G0/G1 do ciclo celular, iii) aumenta a taxa de apoptose de mTEC, iv) diminui a força de adesão mTEC-mTEC, v) promove regulação diferencial dos marcadores de superfície clássicos de mTEC, vi) modula genes que codificam moléculas de adesão, vii) modula genes envolvidos na via de apresentação de antígeno após estímulo com IFNγ (MHC II, CIITA, CD74), e viii) não altera vias de processamento de antígeno na etapa lisossomal. Em contra partida, a transdução (superexpressão) do gene Aire inibe as respostas induzidas por IFNγ. Concluindo, mTECs E6 apresentam diminuição da adesão mTEC-mTEC, sendo este o primeiro estudo a abordar o tema. Embora as mTECs E6 apresentem antígenos de forma semelhante às WT, apenas algumas moléculas relacionadas à apresentação (MHC II e transativadores de moléculas MHC II) e ao processamento de antígenos (CD74) parecem estar sob a influência do gene Aire, no modelo estudado. (AU)

• Processo FAPESP: 19/23448-3 - Efeito de mutações no gene Aire (Síndrome APS1) induzidas por CRISPR-Cas9 na conformação da proteína, no transcriptoma de células mTEC e na sua interação com timócitos
• Beneficiário: Ana Carolina Monteleone Cassiano
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado Direto