Avaliação do papel funcional de proteínas de superfície de Leptospira interrogans como receptores de células endoteliais e epiteliais do hospedeiro

Autor(es)

Maria Beatriz Takahashi

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: São Paulo.
• Instituição: Universidade de São Paulo (USP). Instituto de Ciências Biomédicas (ICB/SDI)
• Data de defesa: 2023-05-24

Membros da banca

Ana Lucia Tabet Oller do Nascimento; Regina Lúcia Baldini; Fábio Luís Forti; Eliana Nakano; Katia Cristina Pereira Oliveira Santos; Luiziana Ferreira da Silva

• Orientador: Ana Lucia Tabet Oller do Nascimento

Resumo

A leptospirose é uma zoonose amplamente disseminada causada por espécies patogênicas do gênero Leptospira. Esta doença ocorre de forma endêmica em várias partes do mundo, sendo que no Brasil, as epidemias mais frequentes ocorrem nas comunidades pobres durante o período de chuvas, associados a enchentes e condições precárias de saneamento. O entendimento dos mecanismos de patogenicidade das leptospiras é fundamental para bloquear a ação deste patógeno. Nesse sentido, a identificação de proteínas conservadas da membrana externa são os principais alvos de pesquisa, visto que essa localização facilita a interação com o hospedeiro. Diversos estudos têm buscado caracterizar o papel de proteínas de superfície de L. interrogans com componentes do hospedeiro. Assim, o presente estudo tem como proposta avaliar in vitro o envolvimento das proteínas LipL21, LipL41, Lip46, OmpL1 e OmpL37 como receptores de células endoteliais e epiteliais. Os genes de interesse foram amplificados por PCR e clonados no vetor pET-SUMO. Os sequenciamentos e análise de restrição das construções obtidas mostraram que os genes foram clonados em fase de leitura correta. Pelo teste de expressão em quatro estirpes de Escherichia coli, foi possível determinar o aumento de solubilidade e de expressão das proteínas recombinantes. Todas as proteínas recombinantes foram purificadas com sucesso e apresentaram estrutura secundária como visto pela análise de dicroísmo circular. A adesão aos componentes de matriz extracelular e interação aos componentes do plasma mostraram que OmpL37, OmpL1 e LipL46 foram capazes de interagir com vários componentes. As proteínas LipL21 e LipL41 apresentaram um potencial elevado de interações, pois se ligaram a maioria dos componentes. A ligação ao plasminogênio pelas proteínas foi inibida pela presença de ácido aminocaproico, sugerindo que a ligação ao plasminogênio ocorre via domínios kringle. Dentre estas duas proteínas, apenas LipL41 foi capaz de recrutar plasminogênio do soro normal humano e converter plasminogênio em plasmina. Ambas proteínas não foram capazes de diminuir a formação do coágulo de fibrina, apesar de se ligarem ao fibrinogênio. Os ensaios de adesão das leptospiras às células de mamíferos mostraram a capacidade das bactérias virulentas se ligarem mais que as atenuadas e saprofíticas, respectivamente. A avaliação da ligação das proteínas recombinantes às células sugere que todas as proteínas foram capazes de interagir com células do hospedeiro, porém apenas OmpL1 e LipL41 foram capazes de interagir com todas as linhagens tanto em monocamadas quanto em suspensão. Ensaios de competição utilizando anticorpos policlonais e proteínas recombinantes mostraram a inibição da ligação de L. interrogans às células. A adesão da proteína OmpL1 a células endoteliais foi inibida quando pré-incubada com colágeno IV, sugerindo que ambas podem se ligar ao mesmo receptor. Portanto, os resultados obtidos mostraram que as proteínas majoritárias de membrana são capazes de interagir com as células de mamífero in vitro, sendo que as proteínas OmpL1 e LipL41 podem estar relacionadas a adesão da bactéria ao hospedeiro. Os dados sugerem que essas proteínas podem estar envolvidas no processo de colonização na patogênese. (AU)

• Processo FAPESP: 17/26223-7 - Avaliação do papel funcional de proteínas de superfície de Leptospira interrogans como receptores de células endoteliais e epiteliais do hospedeiro
• Beneficiário: Maria Beatriz Takahashi
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado Direto