Purificação de imunoglobulina G a partir do plasma ou soro humano utilizando cromatografia de afinidade com ions metalicos imobilizados

Autor(es)

Sandra Vançan

• Tipo de documento: Dissertação de Mestrado
• Imprenta: Campinas, SP.
• Instituição: Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Faculdade de Engenharia Química
• Data de defesa: 1999-10-27

Membros da banca

Sonia Maria Alves Bueno; Cesar Costapinto Santana; Paulo de Tarso Vieira e Rosa

• Orientador: Sonia Maria Alves Bueno

Resumo

Atualmente, a purificação de proteínas do plasma utilizando métodos seletivos (cromatográficos) tem sido visto pela indústria farmacêutica como uma operação necessária, uma vez que proteínas altamente purificadas limitam os riscos de efeitos colaterais em pacientes. Por isso, o desenvolvimento de métodos seletivos de purificação em larga escala são hoje indispensáveis para aumentar a diversidade, melhorar o rendimento e o grau de pureza das proteínas terapêuticas extraídas do plasma. No presente trabalho estuda-se a viabilidade de separar imunoglobulina G (IgG) a partir do plasma humano utilizando cromatografia de afinidade com íons metálicos imobilizados, IMAC. Esta técnica explora a afinidade de proteínas por íons metálicos imobilizados e tem sido utilizada para purificar várias proteínas e peptídeos. Experimentos cromatográficos foram realizados com IgG humana pura para selecionar o íon metálico entre Cu2+, Ni2+, Zn2+ e Co2+, a ser imobilizado no agente quelante (IDA) e vários tampões foram testados na etapa de adsorção. As proteínas adsorvidas no suporte foram eluídas pela protonação dos grupos doadores de elétrons da proteína reduzindo-se o pH do meio ou por competição com outra espécie doadora de elétrons (gradiente crescente da concentração de imidazol). Estes íons metálicos imobilizados no agente quelante EDA apresentaram diferentes forças de retenção da proteína (IgG humana pura). Selecionado o íon metálico Ni2+, a seletividade do suporte em adsorver IgG foi determinada empregando plasma humano de indivíduos sadios. Como IgG não foi purificada em IDA-Ni2" a níveis expressivos, utilizou-se uma segunda coluna em série com a primeira, a fim de obter maior pureza de IgG. Análises nefelométricas da fiação retida em colunas IDA-Zn em série com IDA-Ni2" e eluída a pH 5,0 mostraram a presença de 41,90% de IgG, 1,34% de IgM, 2,10% de IgA e 54,69% de transferrina. As proteínas contaminantes, transferrina e IgM, podem ser removidas da amostra por cromatografia de filtração em gel. A análise realizada por focalização isoelétrica das frações de lavagem e de eluição dos experimentos conduzidos com IgG humana Sigma, mostrou que a distribuição de pontos isoelétricos nas frações de lavagem e eluição não dependeu do íon metálico imobilizado (dentre os estudados), nem do sistema tamponante utilizado. Observou-se que as frações não retidas (lavagem) apresentaram IgG de baixo pi (entre 5,0 e 6,0). Não obteve-se seletividade na eluição de IgG por decréscimo de pH (íons Ni2^ imobilizado) ou incrementos na concentração de imidazol (íons Ni2+ e Zn2+ imobilizados), todas as frações apresentaram pi de 6,0 a 8,65, não sendo observado a separação (AU)

• Processo FAPESP: 97/05591-2 - Purificacao de imunoglobulina g a partir do plasma humano utilizando cromatografia de afinidade com ions metalicos imobilizados.
• Beneficiário: Sandra Vancan
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Mestrado