Técnicas de fluorescência no monitoramento de membranas modelo

Autor(es)

Cássia Alessandra Marquezin

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: Ribeirão Preto.
• Instituição: Universidade de São Paulo (USP). Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto (PCARP/BC)
• Data de defesa: 2008-12-05

Membros da banca

Amando Siuiti Ito; Roberto Morato Fernandez; Eneida de Paula; Karin do Amaral Riske; Maria Elisabete Darbello Zaniquelli

• Orientador: Amando Siuiti Ito

Resumo

Apresentamos os resultados de estudos sobre a utilização de técnicas baseadas no fenômeno de fluorescência para a investigação de processos relacionados a membranas modelo. Nessa investigação, estão envolvidas medidas de propriedades espectrais de absorção e emissão de luz por cromóforos adequados, determinação xperimental de perfis de decaimento temporal da fluorescência e correlação temporal de emissão fluorescente, bem como a utilização apropriada de metodologias para análise e interpretação dos dados experimentais. Foram utilizados diversos compostos que apresentam absorção e emissão na região ultravioleta/visível, como as sondas lipofílicas 2-Amino-N-hexadecil-benzamida (Ahba), 6-lauryl-2-dimethylaminonaphthalene (Laurdan), N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3- diazol-4-yl) (NBD), em diferentes condições: meio aquoso homogêneo, suspensões de micelas de Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), Cetyl-trimethyl-ammonium-bromide (CTAB) e 3-(Dodecyl-Dimethyl-Ammonio)-propane-sulfonate (DPS) e vesículas de fosfolipídios, como o 1,2-Dimyristoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine (DMPC), o 1,2-Dimyristoyl-sn-Glycero-3-[Phospho-rac-(1-glycerol)](Sodium Salt) (DMPG) e o 1-Palmitoyl-2-Oleoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine (POPC). Supressores alquilpiridínios de diferentes comprimentos da cadeia alquila e, portanto, diferentes afinidades por agregados anfifílicos, foram utilizados em experimentos de supressão da fluorescência da sonda Ahba. Usando o formalismo que descreve fenômenos de supressão dependente de colisões entre fluoróforo e supressor, observamos que as taxas de supressão são maiores em presença de agregados anfifílicos carregados negativamente: micelas de SDS e vesículas de DMPG; em micelas zwiteriônicas o processo é mais eficiente quando a hidrofobicidade do supressor é grande, o que ocorre quando a cadeia alquila é mais longa. Realizamos experimentos de transferência de energia por ressonância de Förster (FRET) onde o grupo fluorescente da sonda lipofílica Ahba atuou como doador. Como aceitadores utilizamos os compostos Acridina Laranja, -(2,4,dinitrofenil)-etilenodiamina (Eddnp) e o NBD ligado a fosfolipídios. Fizemos uso do programa CONTIN para análise de dados experimentais de perfis de decaimento da fluorescência em sistemas em que ocorre transferência de energia e obtivemos distribuições de distâncias para os pares Ahba/Eddnp e Ahba/NBD-fosfolipídios na presença de vesículas de fosfolipídios. Para este último par, verificou-se que a distribuição de distâncias depende da temperatura do sistema, ou seja, da fase da bicamada, da concentração de aceitador e da posição onde o NBD está ligado ao fosfolipídio. Analisamos a utilização da sonda Laurdan em presença de vesículas de DMPC e POPC, em experimentos de espectroscopia de correlação de fluorescência. Embora tenha apresentado sinal elevado de fluorescência, a sonda é fotodegradável. Os mesmos experimentos de correlação de fluorescência foram realizados com o Ahba que, apesar de ter se mostrado bastante fotoestável, revelou não ser uma sonda adequada para uso em tal técnica. O espectro de excitação a dois fótons foi obtido para esta sonda, com máximo de absorção em 695 nm. Em experimentos de microscopia de fluorescência, o Ahba mostrou ser um bom marcador fluorescente para membranas lipídicas, ao possibilitar a aquisição de imagens de fluorescência de vesículas gigantes marcadas. (AU)

• Processo FAPESP: 03/13403-4 - Novas sondas fluorescentes em estudos dinamicos da interacao peptideo-membranas.
• Beneficiário: Cassia Alessandra Marquezin
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado