Caracterização da proteína anônima relacionada à trombospondina 2 (TRAP 2) do protozoário Neospora caninum no processo de invasão celular

Autor(es)

Luiz Miguel Pereira

• Tipo de documento: Dissertação de Mestrado
• Imprenta: Ribeirão Preto.
• Instituição: Universidade de São Paulo (USP). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto (PCARP/BC)
• Data de defesa: 2009-04-28

Membros da banca

Ana Patricia Yatsuda Natsui; Sergio de Albuquerque; Tiago Wilson Patriarca Mineo

• Orientador: Ana Patricia Yatsuda Natsui

Resumo

Neospora caninum é um protozoário Apicomplexa, parasita intracelular obrigatório que possui o cão como hospedeiro definitivo e principalmente os bovinos como hospedeiros intermediários, causando nos primeiros encefalopatia e nos últimos abortos com perda da fertilidade, o que acarreta prejuízos significativos na pecuária mundial. O parasita necessita multiplicar de modo intra-celular, utilizando a descarga de proteínas contidas em organelas filo-específicas, como as micronemas que liberam proteínas relacionadas a adesão e invasão ativa, além das roptrias e os grânulos densos. Este trabalho foi realizado sobre um tipo de proteína micronêmica denominada proteína Anônima Relacionada à Trombospondina (TRAP), relacionada à adesão e ligação com o motor intracelular, responsável pelo processo ativo de invasão. TRAP 1 já havia sido descrita pela literatura e o objetivo deste trabalho foi a caracterização molecular do até então desconhecido homólogo TRAP 2, com expressão de suas formas recombinantes e o uso de seus respectivos anti-soros para ensaios funcionais e localização da proteína nativa. Com base em banco dados de ESTs e genômicos de N. caninum e fazendo uso de RLM-RACE (Reação mediada por RNA ligase- amplificação rápida dos términos de cDNA-RNA,) foi possível a obtenção da sequencia completa do gene NcTrap 2, que possui quatro éxons separados por três íntrons. Sua forma protéica, como seu homológo, é formado por um peptídeo sinal, uma integrina, cinco trombospondinas, uma região transmembrana e a cauda citoplasmática. A integrina e as trombospondinas são motivos relacionados à adesão para início do processo invasivo e foram os alvos deste trabalho. Foram expressos dois recombinantes a partir deste cerne funcional (integrina e trombospondinas), com 52 e 78 kDa, e seus respectivos anti-soros foram obtidos. Estes foram utilizados em western blots 1D e 2D para localização da forma nativa de NcTRAP 2 de aproximadamente 80 kDa no extrato total e de sua forma processada no ESA (extrato secretado, simulando o momento invasivo do taquizoíta) com 70 kDa. O soro contra o recombinante 1 teve a capacidade de inibir o processo invasivo em valores de 53 a 61%, dependendo do método utilizado (contagem manual ou real time PCR). NcTRAP 2 foi encontrada no complexo apical parasitário do taquizoíta por imunofluorêscencia confocal, evidenciando sua provável localização nas micronemas. A nova molécula, NcTRAP 2 possui características que a diferencia de NcTRAP 1 o suficiente para ser considerada homóloga. O soro contra sua forma recombinante detectou as formas nativas integral e secretada e demonstrou que NcTRAP 2 possui capacidade de inibir a invasão dos taquizoítas, o que a torna um interessante alvo vacinal. (AU)

• Processo FAPESP: 06/05936-0 - Caracterizacao da proteina anonima relacionada a trombospondina 29trap-2) do protozoario neospora caninum no processo de invasao celular.
• Beneficiário: Luiz Miguel Pereira
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Mestrado