Utilização de células CHO cultivadas na presença de cicloheximida para obtenção e caracterização de prolactina humana glicosilada (G-hPRL) recombinante

Autor(es)

Susana da Rocha Heller

• Tipo de documento: Dissertação de Mestrado
• Imprenta: São Paulo.
• Instituição: Universidade de São Paulo (USP). Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares (IPEN/BT)
• Data de defesa: 2008-09-15

Membros da banca

Carlos Roberto Jorge Soares; Andrea Glezer; Eric Kinnosuke Martins Ueda

• Orientador: Carlos Roberto Jorge Soares

Resumo

A Prolactina humana hPRL é um hormônio protéico com 199 aminoácidos (MM ~ 23.000 Da) com um amplo espectro de atividades biológicas, sendo mais conhecido por estimular a lactação e regular o crescimento e diferenciação da glândula mamária. Além de quebra proteolítica, a maioria dos variantes de prolactina podem ser resultantes de outros processos pós-traducionais como polimerização, fosforilação, desamidação, sulfatação e glicosilação. Essa proteína contém apenas um sítio potencial de glicosilação por ligação à asparagina, localizada no aminoácido 31, que é parcialmente ocupado (10%) quando a proteína é sintetizada em células eucariotas. Apesar da atividade biológica in vitro da prolactina glicosilada (G-hPRL) ser muito menor (~4 vezes) quando comparada à não glicosilada, sua função fisiológica ainda não é bem definida e a porção de carboidrato parece ter um importante papel na biossíntese, secreção, atividade biológica, e clearance plasmático do hormônio. Com o objetivo de melhor caracterizar e estudar esta variante hormonal, foi realizada sua purificação em escala laboratorial a partir de células de ovário de hamster chinês (CHO) modificadas geneticamente, utilizando meio de cultura suplementado com cicloheximida, aumentando ~4 vezes sua concentração absoluta e ~10 vezes a razão entre a isoforma glicosilada e a não-glicosilada. A purificação da G-hPRL seguiu um processo simples e efetivo de duas etapas principais baseado em uma coluna de troca catiônica e uma coluna preparativa de exclusão molecular acoplada a um sistema de cromatografia líquida de excusão molecular de alta eficiência (HPSEC). A caracterização foi feita por HPLC de fase reversa (RP-HPLC) e exclusão molecular, SDS-PAGE, Western Blotting, espectometria de massa (MALDI-TOF) e um bioensaio in vitro utilizando células Nb2 e Ba/F3-LLP. Nossos resultados demostram que a cicloheximida pode ser uma importante ferramenta para aumentar a produção de prolactina glicosilada, facilitando a purificação e caracterização dessa isoforma. (AU)

• Processo FAPESP: 06/52973-9 - Sintese, purificacao e caracterizacao da prolactina humana glicosilada produzida em celulas de ovario de hamster chines.
• Beneficiário: Susana da Rocha Heller
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Mestrado