Desenvolvimento e aplicação do ELISA indireto com proteína recombinante de nucleocapsídeo de coronavírus felino (FCoV) para quantificação de anticorpos em soros de gatos naturalmente infectados

Autor(es)

Ariani Cristina da Silva Almeida

• Tipo de documento: Dissertação de Mestrado
• Imprenta: Botucatu. 2014-08-13.
• Instituição: Universidade Estadual Paulista (Unesp). Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia. Botucatu
• Data de defesa: 2013-06-21
• Orientador: João Pessoa Araújo Junior

Resumo

O Coronavírus felino (FCoV) é um membro da ordem Nidovirales, família Coronaviridae, gênero Alphacoronavírus, que é responsável por causar a peritonite infecciosa felina (PIF). Dentre os testes sorológicos utilizados no auxílio ao diagnóstico da doença, o método mais sensível e recomendado é o ELISA. O FCoV apresenta características que dificultam seu cultivo celular, sendo necessário o uso de antígenos recombinantes no ELISA. A proteína de nucleocapsídeo (N) do FCoV apresenta vantagens no seu uso como antígeno recombinante em testes sorológicos, por ser conservada, altamente imunogênica, e ser uma das mais produzidas durante a infecção viral. O objetivo deste trabalho foi padronizar e aplicar o ELISA indireto com uso de proteína N recombinante para detectar anticorpos anti-FCoV em soros de gatos naturalmente infectados. Um fragmento de rim de um felino que veio a óbito com PIF foi utilizado para extração de RNA viral, amplificação pela RT-PCR e sequenciamento da proteína N. A sequência da proteína N foi sintetizada com códons otimizados para expressão em Escherichia coli e inserida no plasmídeo pGS21a. Após sua produção, a proteína foi purificada. Foi realizado o Western blott com soro de gato naturalmente infectado para a confirmação da reatividade da proteína. Na padronização do ELISA indireto foi determinada o tipo de bloqueio, concentração de antígeno e diluição dos soros. Trezentos e oitenta e duas amostras de soros felinos foram testadas. Os resultados obtidos mostraram que a proteína produzida apresentou ótima reatividade no ELISA indireto. Foram encontradas diferenças de A450 entre os soros testados, onde se demonstrou uma alta capacidade de discriminação com A450 de 0,1 a 1,8, mostrando que o teste é quantitativo. O ELISA indireto padronizado para detecção de anticorpos anti-FCoV utilizando a proteína N recombinante é um método eficiente e pode ser aplicado em amostras de campo (AU)

• Processo FAPESP: 11/04677-0 - Desenvolvimento e aplicação do ELISA indireto com proteína recombinante de nucleocapsídeo do coronavírus felino (FCoV) para quantificação de anticorpos em soros de gatos naturalmente infectados
• Beneficiário: Ariani Cristina da Silva Almeida
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Mestrado