Desenvolvimento de técnicas de imuno-ensaio para a detecção de microcistina e anatoxina-a em amostras ambientais

Resumo

A contaminação por fontes antropogênicas de reservatórios e mananciais de água tem provocado o crescimento acelerado de algumas espécies de cianobactérias. O fenômeno é conhecido como floração ou "bloom" e pode trazer risco a população, pois um terço dos 50 gêneros de cianobactérias são capazes de produzir toxinas. Os mecanismos de toxicidade dessas substâncias são diversos e podem ser hepatotóxicas, neurotóxicas, dermatotóxicas ou promover a inibição da síntese de proteínas. As toxinas mais estudadas são as microcistinas e as anatoxinas, tendo como alvo o fígado (induzindo a formação de tumores) e o sistema nervoso central, respectivamente.Atualmente existem métodos de detecção e quantificação destas toxinas por HPLC, CG-MS e LC-MS. No entanto, estes métodos apresentam alto custo e não são normalmente utilizados como "screening" para verificar a presença de toxinas. Existem no mercado kits baseados em técnicas de imuno-ensaio para detecção de microcistinas. No entanto, eles não são capazes de diferenciar entre as variantes de microcistinas e/ou utilizam anticorpos policlonais. Por isso, propomos o desenvolvimento de novas técnicas de enzima imuno-ensaio (ELISA) com anticorpos monoclonais, para ser aplicado em análises do Controle de Qualidade de Água. Pretendemos em longo prazo desenvolver as seguintes etapas: (I) isolar as variantes de microcistina - LR, RR, YR e 3Asp-LR de cepas disponíveis em laboratório; (II) conjugar as variantes de microcistinas e a anatoxina-a com proteína carreadora; (III) imunizar camundongos Balb/c com diferentes protocolos e adjuvantes; (IV) analisar soros imunes de camundongos por ELISA e imunoblot; (V) produzir hibridomas; (VI) caracterizar e analisar os anticorpos monoclonais obtidos (VII) delinear o emprego dos anticorpos monoclonais mais relevantes (VIII) padronizar ensaios utilizando anticorpos monoclonais obtidos para pesquisa da toxina em amostras ambientais. Este projeto conta com o suporte financeiro da FAPESP, Projeto Políticas Públicas Nº 03/06443-0. (AU)