Expressão da proteína fluorescente verde (GFP) como marcador de células de origem fetal em gestações de clones bovinos

Resumo

A utilização da proteína fluorescente verde (GFP) como marcador de células de origem fetal nas placentas de clones bovinos servirá de modelo inédito para estudo morfofisiológico e imunológico da interação materno-fetal, visto que possibilitará o seu mapeamento, diferenciando as células fetais das maternas. Tal modelo terá aplicação direta, principalmente porque estes são animais que apresentam problemas em relação ao seu desenvolvimento. Com o auxílio deste modelo, pretendemos verificar, além dos processos imunológicos, a migração de células fetais para o epitélio uterino, apoptose, proliferação celular e o transporte de substâncias entre a mãe e o feto. Para tanto utilizaremos 08 bovinos clonados e 08 bovinos de fertilização in vitro (FIV) e 30 bovinos de IA ou monta natural com idade até 90 dias de gestação, os quais terão seu desenvolvimento interrompido mediante abate humanitário das receptoras e recuperação do útero gestante. Serão coletadas as membranas fetais (âmnio, alantoide e cório), placentônios, carúnculas e áreas intercarunculares. Uma parte das amostras será recortada e fixada, por imersão, em solução de paraformoldeído a 4% ou formoldeído a 10% em tampão fosfato de sódio (PBS) a 0,1M pH 7.4, solução de Zamboni (4% de paraformoldeído, 15% de ácido pícrico, em tampão fosfato de sódio a 0,1M pH 7.4), metacarn (60% de metanol, 30% de clorofórmio, e 10% de ácido acético glacial), para verificação da morfologia e realização de imunoistoquímica ou glutaraldeído a 2,5 % PBS para microscopia eletrônica de transmissão. Uma parte das amostras será coletada em nitrogênio líquido para extração do mRNA e verificação da expressão do gene Bola do MHC (homólogo ao Ped de camundongo), e para a realização de técnica de imunoistoquímica em cortes congelados. Os resultados obtidos serão comparados entre bovinos clonados, FIV, de IA ou monta natural para auxílio da detecção das razões de tantas alterações placentárias, perdas embrionárias, abortos espontâneos, mortalidade pós-natal e síndrome do bezerro grande em animais manipulados em laboratório. (AU)