Decifrando os mecanismos moleculares envolvidos na localização intracelular de proteínas em plantas

Resumo

Este laboratório tem como uma das suas principais linhas de pesquisa estudos visando o entendimento dos mecanismos responsáveis pela localização de proteínas dentro das células de plantas, especialmente as proteínas direcionadas às mitocôndrias e cloroplastos. Nesta proposta, pretende-se avançar na caracterização dos mecanismos regulatórios envolvidos na localização intracelular de diferentes proteínas, integrando também uma abordagem evolutiva. Quatro subprojetos são apresentados. O primeiro deles refere-se à identificação de proteínas que interagem com a proteína THI1 de Arabidopsis thaliana, via técnica do duplo-híbrido, e que participem da biossíntese de tiamina. Além disso, pretende-se identificar proteínas responsáveis pelo controle do duplo direcionamento desta proteína, já que foi mostrado por este grupo que esta proteína é direcionada simultaneamente às mitocôndrias e cloroplastos via um mecanismo de regulação pós-transcricional. O segundo subprojeto tem como objetivo realizar um estudo sobre a biossíntese da tiamina em plantas. Estudos preliminares realizados por este grupo envolvendo técnicas de bioinformática e filogenia molecular sugerem que a biossíntese de tiamina em plantas possa envolver outros compartimentos subcelulares, contrariando trabalhos prévios que sugerem a ocorrência apenas nos plastídios. Portanto, nesta proposta serão adicionadas a esta análise de bioinformática, experimentos de complementação funcional em leveduras de genes da biossíntese de tiamina e a posterior determinação da localização subcelular de todas as proteínas envolvidas no processo, via fusão com a proteína fluorescente verde GFP. O terceiro projeto visa entender um dos mais fascinantes mecanismos de regulação gênica descritos recentemente: os riboswitches. A presença de estruturas no mRNA capazes de interagir diretamente com moléculas interferindo na tradução tem despertado o interesse de vários grupos em todo o mundo. No caso de um dos genes envolvidos na biossíntese da tiamina, thic de Arabidopsis thaliana, foi mostrado que ele apresenta uma estrutura em aptâmero capaz de se ligar a tiamina pirofosfato (TPP) e tiamina, regulando sua expressão. Pretende-se verificar experimentalmente se a ocorrência deste aptâmero interfere na expressão do gene thic e na sua localização subcelular. Além disso, será realizado um estudo in silico em todos os genes cujos produtos estejam envolvidos na biossíntese de tiamina a fim de identificar a ocorrência de aptâmeros e, em caso positivo, verificar experimentalmente a sua função. O quarto subprojeto envolve a caracterização do mecanismo responsável pela localização de uma metaloprotease da membrana do tilacóide, a FtsH-p1. Membros desta família foram descritos como pertencentes ao sistema Tat (twin-arginine translocation system) para inserção na membrana do tilacóide. Em um trabalho prévio deste grupo, foi mostrado que um membro desta família não apresenta o clássico motivo RR responsável pela sua inserção na membrana. Portanto, pretende-se caracterizar o mecanismo responsável pela localização de proteína, pois trata-se provavelmente de um mecanismo distinto do que se tem descrito na literatura. (AU)