Análise dos receptores e das vias de sinalização celular relacionadas a atividade proteolítica do peptídeo derivado da laminina AG73 em linhagens glandulares normais e neoplásticas

Resumo

Estudaremos os receptores e as vias de sinalização celular relacionadas à atividade proteolítica modulada pelo peptídeo derivado da laminina AG73. Utilizaremos linhagens de glândula salivar normal e de neoplasias benignas e malignas de glândulas salivares. Para estudar os potenciais receptores do peptídeo AG73, faremos colunas de afinidade com esse peptídeo imobilizado. Membranas das linhagens celulares serão passadas em colunas de afinidade com AG73, visando eluição dos potenciais ligantes, que serão resolvidos em gel de eletroforese, sequenciados por espectrometria de massa e "peptide fingerprinting". Para analisar se os ligantes identificados seriam associados à atividade proteolítica induzida por AG73 realizaremos bloqueio de função com anticorpos contra esses receptores. Células com receptores bloqueados serão colocadas em contato com o peptídeo, para análise da atividade proteolítica por zimografia. Para o estudo das vias de sinalização celular trataremos as linhagens celulares com diferentes inibidores dessas vias. Células tratadas por esses inibidores serão submetidas a ensaios funcionais de atividade de protease. A atividade proteolítica é extremamente relacionada aos fenômenos de migração e, principalmente, invasão. Dessa forma, e finalizando o projeto, estudaremos se o peptídeo AG73 induz migração e/ou invasão das linhagens em questão. Isso será realizado através de câmaras apropriadas do tipo multipoço, com posterior análise da migração e/ou invasão por fluorimetria. (AU)