Contribuição do estresse oxidativo para a integridade da barreira de filtração glomerular em ratos diabéticos e hipertensos

Resumo

O estresse oxidativo ocasiona alterações na barreira de filtração glomerular, consequentemente levando albuminúria característica da nefropatia diabética (ND). Tratamentos com antioxidantes como tempol previnem albuminúria em ratos diabéticos e hipertensos pela diminuição da apoptose de podócitos. Os objetivos de presente trabalho serão: 1. Verificar se antioxidantes (tempol, cacau e chá-verde) previnem a apoptose de podócitos via inibição de PARP-1, na presença de diabetes (DM) e hipertensão (HA), in vivo e in vitro; 2. Investigar a influência dos antioxidantes na integridade da barreira de filtração glomerular, na presença de DM e HA, in vivo e in vitro. DM será induzida por estreptozotocina em ratos espontaneamente hipertensos (SHR) e normotensos (WKY) com 4 semanas de idade. Ratos controles e diabéticos receberão ou não tratamentos com antioxidantes, e após 20 dias de indução de DM, os ratos serão sacrificados e os rins coletados. Linhagem de podócitos será cultivada em condições de normoglicemia e hiperglicemia, estresse oxidativo (tratamento com H2O2), presença/ausência dos antioxidantes e com/sem estiramento mecânico (mimetizar hipertensão). Alguns animais e podócitos receberão inibidor de PARP-1, ou será feita superexpressão de PARP-1 in vitro. A análise da apoptose de podócitos será feita por TUNEL, atividade de caspase-3 e co-localização por imunofluorescência para marcador específico de podócitos (WT-1) e caspase-3. A integridade da barreira de filtração glomerular será analisada por: western blot, imunofluorescência e RT-PCR de proteínas como nefrina, ZO-1, P-caderina, podocalexina e laminina b2; imunohistoquímica para proteoglicanas da membrana basal glomerular (MBG) e glicoproteínas do glicocálix endotelial; microscopia eletrônica para verificar a estrutura da barreira glomerular; detecção de alterações nas cargas negativas da MBG. Portanto, o entendimento do mecanismo em que a proteinúria ocorre em função do estresse oxidativo na presença de DM e HA, permitirá o uso de antioxidantes como uma terapêutica potencial na ND.