Origem e evolução estrutural da atividade oxigenase/luciferásica em AMP/CoA-ligases e luciferases de besouros

Resumo

As luciferases de besouros, se originaram a partir de AMP-ligases. Por terem duas funções catalíticas, de AMP/CoA-ligase e de oxigenase bioluminescente, constituem modelos muito úteis para investigar a origem estrutural e funcional de novas funções catalíticas em enzimas durante a evolução. Dada a importância biotecnológica das luciferases, tais conhecimentos de estrutura, função e evolução molecular são também essenciais para desenvolver luciferases e até implementar atividade bioluminescente em novas enzimas com diferentes propriedades e maior aplicabilidade. Até o momento somente as estruturas tridimensionais das luciferases emissoras de luz verde-amarela dos vagalumes lampirídeos Photinus pyralis, na ausência de substratos, e Luciola cruciata na presença do análogo DLSA foram resolvidas, e várias luciferases de besouros emissoras de diferentes cores de bioluminescência foram clonadas e a relação entre estrutura e espectros de bioluminescência foram parcialmente investigadas em alguns deste modelos. Entretanto, a origem estrutural e evolutiva da função oxigenásica, que confere a atividade bioluminescente nas luciferases, permanece praticamente desconhecida. Recentemente clonamos uma enzima tipo-luciferase de Zophobas morio que constitui um modelo ideal de protoluciferase. Através da caracterização desta enzima e estudos comparativos com luciferases de besouros clonadas pelo nosso grupo, já identificamos um importante determinante estrutural da atividade luciferásica nesta enzima. Porém estes estudos ainda estão incompletos e os resíduos e partes do sítio-ativo diretamente envolvidos com a atividade oxigenásica precisam ser determinados. Além disto, a função enzimática e substrato natural desta enzima ainda não são conhecidos. Assim, neste trabalho investigaremos: (1) a relação entre estrutura e atividade luciferásica nesta enzima e em luciferases típicas, através de estudos de mutagênese sítio-dirigida e randômica; (2) a atividade tioesterásica na presença de diferentes substratos carboxílicos para identificar o possível substrato natural e função desta enzimas; (3) a atividade oxigenásica comparativa com as luciferases de besouros clonadas e (4) a estrutura do sítio ativo na presença de CoA e análogos de luciferina para identificarmos o sítio de ligação do oxigênio. (AU)