Instabilidade genômica e vias de sinalização molecular envolvendo respostas a danos e reparo do DNA em doenças humanas

Resumo

Sub-projeto-01: O estresse oxidativo tem sido associado à etiopatogenia de doenças humanas, como a doença de Alzheimer (DA) e o Diabetes Mellitus (DM), mas as bases moleculares destas ainda são pouco elucidadas. Considerando a hipótese de que o estresse oxidativo e alterações nos mecanismos de reparo do DNA constituem fatores importantes para o desenvolvimento da DA e do DM tipo 1 (DM1), o projeto tem como objetivos: 1) Análise bioinformática dos perfis de expressão gênica transcricional (dados obtidos por microarranjos), visando detectar genes com expressão significativamente alterada em células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) de pacientes com DA em relação a idosos sadios (estes serão comparados aos dados já obtidos para o grupo DM1: doutorado de Paula Takahashi); 2) Analisar a expressão de alguns genes e proteínas (com base nos resultados obtidos por microarranjos, comparações: DA versus controles e DM1 versus controles) por meio de PCR quantitativa em tempo real e Western blot, respectivamente; 3) Analisar a expressão de microRNAs (microarranjos) em pacientes com DA em relação a idosos sadios (estes serão comparados aos dados já obtidos para o grupo DM1: doutorado de Paula Takahashi), visando buscar a associação dos microRNAs com RNAs mensageiros, principalmente de genes de resposta ao estresse oxidativo/reparo; 4) Validar interações microRNA-RNA mensageiro pelo ensaio do gene repórter luciferase; 5) Estudar a expressão de algumas proteínas-chave da via da TP53, visto que em estudo anterior esta proteína se mostrou mais expressa em DA (Leandro et al., Int J Mol Sci. 14(6): 12380, 2013). Os dados a serem gerados poderão contribuir com informações relevantes para a compreensão do papel do estresse oxidativo e do reparo do DNA na etiopatogenia da DA e DM1, com a possibilidade de detectar vias comuns com regulação gênica modificada nessas doenças.Sub-projeto-02: O glioblastoma multiforme (GBM) é um dos tumores mais letais e a resistência destes aos tratamentos convencionais constitui um grande desafio a ser superado. A presente proposta tem como enfoque a aplicação de inibição molecular (genes de reparo do DNA e fatores de transcrição) visando influenciar as respostas das células de GBM à droga TMZ ou às radiações, no sentido de incrementar a letalidade celular. Os objetivos consistem em avaliar os efeitos da inibição da enzima de reparo PARP-1 pelo agente NU1025 (inibidor de PARP-1) em linhagens de GBM resistentes (LN18 e T98G) à droga TMZ, com diferenças no status do gene PTEN (normal e mutado, respectivamente). A influência de PTEN (o qual também participa na via HR) nas respostas celulares será estudada pela inibição deste por siRNA na linhagem LN18, sendo que a participação do reparo MGMT será também avaliada pela inibição deste (inibidor O6-BG) nas mesmas linhagens (proficientes para esse reparo). Os efeitos dos tratamentos combinados (TMZ + NU1025) serão avaliados por vários ensaios ao nível celular (sobrevivência clonogênica, cinética do ciclo celular, indução de danos no DNA por ³-H2AX e apoptose) e molecular (perfis de expressão gênica, proteica e ensaios funcionais de inibição por siRNA). Além disso, com base em fundamentos da literatura e em dados anteriormente obtidos, a inibição de fatores de transcrição será também testada como possível estratégia para aumentar a letalidade das células de GBM, sendo utilizado o inibidor químico HLM006474, o qual tem como alvo as proteínas da família E2F. Esse inibidor será testado em células de GBM (U87MG e U343MG-a) expostas à irradiação com raios-gama, sendo as respostas celulares avaliadas por meio da vários ensaios funcionais ao nível celular e molecular (incluindo o método de microarranjos). Adicionalmente, o background genético dessas células será também considerado na interpretação dos dados, sendo que alguns genes de interesse serão sequenciados. (AU)