Efeito do verniz de tetrafluoreto de titânio sobre fibroblastos (NIH3T3): ensaios de viabilidade, morfologia e sinalização celular para apoptose

Resumo

O objetivo do projeto será avaliar a citotoxicidade do verniz de tetrafluoreto de titânio (TiF4) comparado ao fluoreto de sódio (NaF), independentemente da concentração de fluoreto e tempo de tratamento, pela análise da viabilidade, morfologia e tipo de morte celular (apoptose e necrose). NIH3T3 serão cultivados em DMEM suplementado com soro fetal bovino 10%, a 37o C, em atmosfera úmida, a 5% CO2. As células serão tratadas com DMEM contendo verniz de TiF4 ou NaF (F a 0,95%, 1,9% e 2,45%) em microplacas de 24 poços. Após 6, 12 e 24 h, as células serão submetidas ao teste de viabilidade (n=6, MTT) e análise morfológica (n=3, imagens HE). Adicionalmente, sinais celulares envolvidos na apoptose serão avaliados (n=3): padrões de apoptose mediados pela mitocôndria ou pelo receptor da morte. As células serão coradas com Hoechst 342 e iodeto para diferenciação entre necrose e apoptose, assim como serão examinadas pelo método do TUNEL, usando microscopia de fluorescência e confocal, respectivamente. A atividade das caspases-3, -8 e -9 serão avaliadas pelo leitor de ELISA a partir de uso de kits de ensaio. O RNAm será isolado e o DNAc para citocromo c, proteínas Bax, Bad (pró-apoptóticas), Bcl-2 (anti-apoptótica), PARP (polimerase poli(Ribose-ADP)), VDAC (canal iônico dependente de voltagem) e Fas-L (ligante ao receptor da morte) obtido por transcrição reversa será amplificado por PCR quantitativo (qPCR). Por fim, a expressão de citocromo c, das proteínas Bax, Bad, Bcl-2, PARP, VDAC e Fas-L será detectada por Western Blot. O projeto BEPE envolve uma nova análise, onde as células serão tratadas com vernizes TiF4, NaF (2,45% F) ou placebo (6, 12 e 24 horas) em placas de Petri. As células serão identificadas individualmente por microscopia de contraste de fase, e sua rigidez será medida através de Microscopia de Força Atômica, AFM, na Universidade de Cambridge, Reino Unido, sob a supervisão do Prof. Dr. John Michael Edwardson, que é especialista em imagens de biomoléculas usando AFM. A rigidez das células será deduzida a partir da inclinação da curva linear. Os dados serão estatisticamente analisados considerando um nível de significância de 5%. (AU)