Atividade antibiótica e determinação da estrutura de B-defensinas de Bothrops jararaca

Resumo

O grupo coordenado pelo Dr. Inácio Junqueira de Azevedo do Laboratório de Proteômica Funcional do Instituto Butantan descreveu transcritos ²-defensinas símiles no fígado (Defb_fig), glândula de veneno (Defb_glv) e rim (Defb_rim) dessa mesma serpente (comunicação pessoal). Buscas dessas sequências ²-defensinas em "scafolds" do Projeto Genoma da B. jararaca (Almeida 2016), mostraram que o gene Defb_glv é de grande tamanho, cerca de 10 kpb, diferente das outras sequências de ²-defensinas. Um problema dessas construções é que grande parte delas é constituída por Ns (nucleotídeos não definidos).Essas sequências estão sendo estudadas em nosso laboratório para analisar os seus níveis de expressão em diferentes tecidos da B. jararaca. Para complementar essa análise, determinaremos a estrutura genômica dos transcritos Defb_fig e Defb_glv, pois a estrutura gênica do Defb_rim já foi determinada e trata-se de um gene constituído por três exons, como o descrito por Corrêa, 2013 e similar aos genes Defb_01 e Defb_07. Assim como, utilizando peptídeos sintéticos, cujas sequências foram inferidas a partir desses genes, avaliaremos a sua atividade antimicrobiana.O gene Defb_glv será clonado por PCR utilizando primers desenhados para hibridizar nas regiões 5' e 3' UTR do transcrito e enzima PfuUltra II Fusion DNA Polymerase (Agilent) nas condições descritas pelo fabricante. O amplificado será purificado após eletroforese em gel de agarose 0,8% com o kit Zymoclean Gel DNA Recovery (Zymo Research) e clonado utilizando o kit Strataclone Ultra Blunt PCR Cloning kit (Agilent). Os plasmídeos recombinantes serão purificados a partir de clones selecionados por ampicilina e pela interrupção da ²-galactosidase. O sequenciamento será feito no Laboratório de Bacteriologia do Instituto Butantan.O gene Defb_liv será clonado por PCR utilizando primers desenhados para hibridizar nas regiões 5' e 3' UTR do transcrito e enzima Taq Platinum Invitrogen nas condições descritas pelo fabricante. O amplificado será purificado após eletroforese em gel de agarose 1% com o kit Zymoclean Gel DNA Recovery (Zymo Research) eclonado utilizando o kit Zyppy Plasmid Miniprep (Zymo Research). Os plasmídeos serão selecionados por Verificação rápida de plasmídeo (Erik et al 1998). O sequenciamento será feito no Laboratório de Bacteriologia do Instituto Butantan.Para avaliar a suscetibilidade aos peptídeos antimicrobianos, utilizaremos o método de antibiograma de Bauer & Kirby (1966) modificado, com difusão em gotas. Esse método utiliza placas de meio sólido contendo esfregaços de cultura bacteriana sobre o qual são aplicados 10 µl do peptídeo a ser testado.A presença de halos determinará a ação antimicrobiana dos mesmos. Uma vez confirmada a atividade antibacteriana, usaremos ensaios de inibição de crescimento microbiano em meio líquido (CIM), Xiao et al. (2006) modificado. Este método utiliza microplaca de 96 poços, onde 10 µl de cada peptídeo são misturados a 90 µl de meio de cultura que contém 4x105 ufc. Após incubação a 37 °C por 16 hs, o crescimento será monitorado em leitor de microplaca Epoch (Biotek). A CIM de cada peptídeo será determinada pela menor concentração de peptídeo capaz de inibir 90% do crescimento bacteriano.Serão testadas atividade antibacteriana contra bactérias Gram negativas: Klebsiella pneumonia, Serratia marcescens, Morganella morganii, Providencia rettgeri e Citrobacter freundii obtidas da flora bacteriana de serpentes, cedidas pela Dra Márcia Regina Franzolin do Laboratório de Bacteriologia do Instituto Butantan e Escherichia coli; e Gram positivas: Micrococcus luteus (A270) da coleção do Instituto Pasteur (Paris, França).