Estudo cinético e mecanístico da atividade enzimática das old yellow enzymes de Leishmania braziliensis e Trypanosoma cruzi

Resumo

Enzimas oxidoredutases são essenciais nos processos bioquímicos dos organismos vivos, sendo, portanto, um alvo importante de controle de patologias causadas por parasitas. A enzima Old Yellow Enzyme (OYE) é uma NAD(P)H oxidoredutase que utiliza uma molécula de flavina adenina mononucleotídeo (FMN) como espécie transiente para a transferência de elétrons em processos redox. A enzima está presente em vários seres vivos como fungos, plantas e bactérias, no entanto, não é encontrada em metazoários. Patologias como a leishmaniose visceral e a doença de Chagas são provocadas por protozoários que produzem OYEs. O mecanismo químico destas enzimas envolve a transferência de elétrons do NAD(P)H para o FMN que por sua vez promove a redução de substratos ±,²-insaturados ativados tais como cetonas, aldeídos, ácido carboxílicos e derivados. O presente projeto pretende expressar, purificar e caracterizar funcionalmente as OYEs recombinantes de Leishmania braziliensis (LbOYE) e de Trypanosoma cruzi (TcOYE). A estrutura em baixa e alta resolução da TcOYE já foi caracterizada pelo grupo de pesquisa e suportará parte dos estudos a serem desenvolvidos nesta proposta, inclusive da interação com substratos e compostos inibidores por cristalografia de proteínas. A funcionalidade comparativa destas enzimas será estudada com o auxílio das técnicas espectrofotométricas e de ressonância paramagnética de elétrons (EPR) a fim de se verificar, sob diferentes condições, tanto o processo de transferência de elétrons por meio do acompanhamento da redução do FMN quanto a formação de radicais em diferentes substratos em meio anaeróbio. Em posse desta ferramenta analítica será possível entender mais profundamente o processo catalítico das enzimas. Desta forma, o conhecimento básico resultante do presente projeto poderá ser utilizado para desenvolver novas estratégias para o tratamento de doenças causadas por protozoários como a doença de Chagas e leishmanioses. Este projeto também objetiva avaliar a interação de compostos, sabidamente letais para protozoários, com as LbOYE e TcOYE. Considerando os dados obtidos neste projeto pretende-se a publicação de, pelo menos, dois artigos científicos em revistas indexadas da área de bioquímica, biologia estrutural e/ou biofísica molecular.