Aplicação de arcabouços de copolímeros sintéticos para estudos de microscopia crio-eletrônica do transportador de piruvato mitocondrial humano

Resumo

A determinação da estrutura molecular de proteínas de membrana por crio-microscopia eletrônica (cryo-EM) representa a fronteira atual no campo da biologia estrutural. Avanços recentes nas tecnologias de detecção de elétrons e o desenvolvimento de rotinas de processamento de imagem por máxima verossimilhança permitem a descrição rotineira de estruturas de biomoléculas a alta resolução (> 4 Å); Coletivamente, estes avanços sinalizam o início de uma nova era na biologia molecular, onde estruturas em resolução quase atômica não são mais privilégio da cristalografia por difração de raios X. Os desafios atuais estão relacionados com a preparação de amostras; mais especificamente, a extração e purificação sem detergente das amostras de proteína de interesse e a identificação de condições adequadas de congelamento destas durante a preparação das grades. Nos últimos anos - e financiado principalmente pela FAPESP - nosso laboratório ganhou uma experiência substancial na purificação e reconstituição funcional de proteínas da membrana mitocondrial humana, que estão prontas para estudos estruturais. Para este fim, buscamos obter conhecimento prático em abordagens relacionadas ao cryo-EM e propor uma colaboração com o laboratório do Dr. Timothy Dafforn (Universidade de Birmingham, Reino Unido) com o objetivo de superar os desafios acima, fazendo uso de co-polímeros sintéticos. Dr. Dafforn é o pioneiro no uso revolucionário de co-polímeros de estireno-ácido maleico que permitem a extração direta de proteínas de membrana de seu sistema de membrana nativa. Uma vez superados esses desafios, o conjunto de dados de micrografias, utilizado para a determinação da estrutura atômica, será coletado no Laboratório Nacional de Nanotecnologia (LNNano), em Campinas, SP, que abrigará em breve um microscópio eletrônico Titan Krios de última geração, equipado com placa de fase e detector direto de elétrons, entre outros acessórios. (AU)