Estudos biofísicos e bioquímicos do complexo carreador de piruvato mitocondrial e da enzima glutaminase em complexo com novos parceiros

Resumo

O piruvato é o produto final da glicólise e tem um número de destinos intracelulares possíveis, sendo o principal deles a internalização mitocondrial, que é um passo crítico no metabolismo de carboidratos, aminoácidos e lipídeos. Duas proteínas da membrana mitocondrial interna (IMM), chamadas MPC1 e MPC2, foram identificados como as proteínas essenciais para o transporte de piruvato em levedura (S. cerevisiae), Drosophila e humanos. Estas proteínas são preditas como possuindo três hélices transmembrana, com cada subunidade pesando 15 KDa. O complexo macromolecular funcional (MPC1 + MPC2), no entanto, acredita-se que tenha um peso molecular de 150 KDa. Todavia, perguntas importantes, como quais são os papéis das proteínas individualmente (MPC 1 e 2 MPC) no complexo, qual é a estequiometria entre elas no complexo, e quais são os determinantes moleculares do transporte de piruvato não foram abordados até o momento. A fim de contribuir para responder estas questões, o presente projeto propõe, como primeiro objetivo, a caracterização biofísica do complexo e, caso haja tempo disponível, a determinação da estrutura cristalográfica usando sistema de expressão de levedura. Considerando que a MPC é um complexo transmembrana, seria de esperar sérias dificuldades na expressão, purificação e estudos estruturais por cristalografia de raios-X. Estudos bioquímicos e biofísicos (ultra-centrifugação analítica, titulação isotérmica calorimétrica, ressonância plasmônica de superfície, e crio-microscopia eletrônica e/ou negative staining) são previstos e será realizada no complexo MPC purificado, a fim de determinar o seu peso molecular exato, sua estequiometria e arquitetura em geral. No segundo assunto, já é bem documentado que, a fim de manter um fenótipo intensamente proliferativo, as células tumorais dependem da glicólise aeróbica, mesmo sob condições de normóxia, um fenômeno denominado "efeito Warburg". Intensa utilização de glicose impõe às células a necessidade de consumir quantidades mais elevadas de glutamina para gerar energia, carbonos para o ciclo do ácido tricarboxílico e produção de agentes redutores, tais como o NADPH. A enzima glutaminase é o primeiro passo na via glutaminolitica. No entanto, as glutaminases são proteínas complexas que apresentam, além do domínio glutaminolítico, repetições do tipo anquirina e motivos de ligação a receptores nucleares. Neste contexto, este projeto tem como segundo objetivo caracterizar a interação das isoformas de glutaminases com proteínas parceiras recentemente identificados em nosso laboratório através ensaios de duplo híbrido em levedura. Inicialmente, vamos confirmar a interação in vitro através da realização de pull-down e ensaios de filtração em gel com as proteínas expressas em sistema heterólogo. Iremos em seguida, definir a estequiometria, as constantes de dissociação, e como estas interações influenciam a atividade das glutaminase ou a função do parceiro de interação, sempre que o ensaio para a proteína estiver disponível. Todas as interações que formarem complexos estáveis serão sujeitas a ensaios de cristalização e os cristais obtidos serão difratados para resolução estrutural. O projeto proposto tem o potencial de fornecer informações valiosas para a compreensão dos mecanismos de transporte do piruvato pela membrana mitocondrial, bem como tem o potencial de apresentar oportunidades terapêuticas alternativas relativas à função da enzima glutaminase. (AU)