Regulação pós-transcricional da enzima glutaminase por HuR e sua relação com os altos níveis glutaminolíticos tumorais

Resumo

As diferenças genéticas e metabólicas das células tumorais permitem elevadas taxas de divisão, normalmente associadas a um grande consumo de glutamina para a produção de energia e formação de blocos biossintéticos celulares (lipídeos, proteínas e ácidos nucléicos). O primeiro passo do metabolismo deste aminoácido é a conversão em glutamato, catalisada pela enzima glutaminase. Glutaminase possui três isoformas oriundas de dois genes distintos: GLS que codifica para a enzima a Kidney-Type Glutaminase (KGA) e a Glutaminase C (GAC), produtos de splicing alternativo, e GLS2 que codifica para a Liver-type Glutaminase (LGA). Estudos preliminares do laboratório indicam que a KGA e a GAC, diferentes apenas na região C-terminal, são mais expressas em tecidos tumorais do que nos tecidos não-transformados adjacentes. Além disto, a isoforma GAC apresenta níveis de mRNA e proteicos mais elevados em relação à KGA nas linhagens tumorais de mama, quando comparado com cultura de células epiteliais mamárias normais. Estes mesmos estudos indicaram a proteína HuR como potencial reguladora da estabilidade do mRNA da GAC. HuR, altamente expressa em células de câncer, pode estar relacionada com os elevados níveis proteicos de GAC em tecidos tumorais. Durante o mestrado do aluno, foi realizado uma avaliação preliminar de bancos de microarranjo o qual indicou que há uma correlação heterogênea entre HuR, GAC e KGA quanto ao tipo de tecido avaliado. Serão expandidas as avaliações utilizando maior volume de dados de microarranjo e também e RNAseq para validar estes achados. Tal heterogeneidade está provavelmente envolvida com a sublocalização celular da proteína, dado que HuR pode atuar em várias instâncias regulatórias do mRNA, tais como splicing, estabilização e modulação da tradução. Silenciamento da proteína HuR na linhagem de tumor de próstata PC-3, através de sistema viral, levou ao aumento do nível proteico de GAC e diminuição de KGA, enquanto que superexpressão da construção HuR-V5-6xHis levou à redução de GAC e aumento de KGA. Ensaios de atividade de luciferase dirigido pelo 3'UTR destas isoformas e avaliação in silico de sequências regulatórias do íntron 14 (decisivo para a definição entre as proteínas através de splicing alternativo) apontam para a possibilidade de que HuR possa regular a estabilidade/tradução do mRNA de GAC enquanto que também está potencialmente envolvido no splicing alternativo do pre-mRNA GLS e na escolha de KGA, ao menos na linhagem PC-3. A ação de HuR sobre o splicing alternativo de GLS será avaliada pelo (já construído) plasmídeo repórter bicromático contendo o mini gene RG6 e o íntron 14. A atividade enzimática da glutaminase, assim como os níveis extra e intracelulares de nutrientes, especialmente glutamina, serão avaliados por RMN após realizar o knock down ou superexpressão de HuR. Todos os experimentos serão realizados no contexto das linhagens celulares PC-3, DU-145 e a não-transformada imortalizada iPrEC. Resultados preliminares de pull-down mostraram interação direta entre HuR recombinante produzida em sistema heterólogo e o 3'UTR de GAC. A confirmação de tais resultados e estudos de R-EMSA do elemento full length ou de seus subclones irão confirmar a interação, assim como definir as sub-regiões envolvidas. Por fim, experimentos in vitro e em modelo animal serão utilizados para verificar a correlação entre obesidade/inflamação (Através NFkB/HuR) e a atividade glutaminolítica. (AU)