Nanopartículas de ouro associadas à cisteíno-proteases derivadas de Bromelaína: caracterização estrutural e ação colagenolítica

Resumo

A Bromelaína (Bro) é um complexo multiproteico (extraída do abacaxi - Ananas comosus) que se destaca pela presença de pelo menos oito cisteíno-proteases. Em conjunto, estas proteínas apresentam propriedades anti-inflamatórias, anti-coagulantes, anti-tumorais, entre outras, incluindo ainda aplicações nas indústrias de alimentos, cosmética e ambiental. O aumento da estabilidade de proteases é um aspecto fundamental para aplicações, o que pode ser obtido, por exemplo, mediante imobilização em nanopartículas (NPs). Além disso, proteínas podem ser utilizadas durante o processo de síntese de NPs, influenciando nas características físico-químicas das mesmas. Em especial, nanopartículas de ouro (GNPs, "gold nanoparticles") apresentam alta biocompatibilidade e propriedades ópticas, eletrônicas e catalíticas singulares. Com o objetivo de sintetizar e caracterizar novas GNPs produzidas e imobilizadas com proteases, dados preliminares de nosso grupo demonstram que o complexo extrato de Bro atua tanto como agente redutor quanto estabilizante durante o processo de síntese de GNPs. Em contrapartida, uma vez em associação com GNPs, Bro apresentou significativo aumento de estabilidade térmica e recuperação estrutural quando previamente inativada. Frente a membranas de colágeno comerciais, a ação proteolítica da Bro-GNP resultou em perfis estruturais singulares em Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) e Espectroscopia de Absorção no Infravermelho (ATR-FTIR) quando comparada à Bro livre, sugerindo a importância das proteases individuais que a compõem. Uma vez que GNPs também apresentam uso potencial para entrega de drogas (drug delivery), sua associação com proteases com atividade colagenásica possibilita atuação em matriz extracelular, o que torna as Bro-GNPs interessantes para futuros tratamentos anti-tumorais. Considerando estes efeitos significativos, o presente projeto objetiva purificar as oito frações proteolíticas do complexo Bro e utilizá-las em separado na síntese de GNPs. As formas livres de Bro(1-8) e as Bro(1-8)-GNPs produzidas serão caracterizadas estruturalmente por Microscopia de Transmissão Eletrônica (MET) e funcionalmente com substratos peptídicos fluorogênicos e em membranas de colágeno, as quais serão analisadas e comparadas através das Microscopias Confocal de Varredura por Laser (CLSM), MEV e ATR-FTIR. As Bro(1-8)-GNPs produzidas serão testadas quanto à citotoxicidade em células não-tumorais e tumorais, resultados essenciais para continuidade do projeto em modelos animais in vivo. Em paralelo, realizaremos a purificação das quatro principais cisteíno-proteases contidas no extrato comercial de papaína, bem como a síntese e caracterização inicial de Pap(1-4)-GNPs. Em conjunto, esses dados podem representar um avanço na caracterização de complexos proteases-GNPs e darão subsídios para usos biotecnológico e farmacêutico nestas e em outras aplicações.