Construção e caracterização de micro-reatores da proteína clorocatecol 1,2-dioxigenase que utilizam domínios de baixa complexidade como adesivos moleculares

Resumo

Domínios de baixa complexidade (LCDs) são sequências de resíduos de aminoácidos com características estruturais peculiares e ainda pouco exploradas dentro da bioquímica e biofísica molecular. Sua dinâmica de interação é pouco conhecida, bem como suas funções, toxicidade e persistência durante a evolução. Sabe-se, porém, que, se usados como adesivos moleculares em proteínas (chamadas, então, de proteínas quimera), os LCDs são capazes de promover separação de fases (aglomerados), como em gotículas (separação de fase líquido-líquido) ou em fase sólida (agregados irreversíveis). Estas fases formadas por quimeras podem ter suas superfícies químicas controladas, mantendo as propriedades físicas/químicas da proteína original. Essa estratégia permite uma quantidade grande de aplicações, como em engenharia de alimentos e de tecidos, desenvolvimento de vacinas, biossensores, engenharia de alimentos, dentre outras. Neste projeto, propomos o uso da enzima clorocatecol 1,2-dioxigenase (1,2-CCD), que atua na degradação de compostos policíclicos aromáticos e, portanto, com potencial uso em mecanismos de biorremediação, como caso de estudo para fabricação de micro-reatores enzimáticos constituídos por enzimas quimeras contendo LCDs. Como processo controle, usaremos a produção de proteínas quimera da Green Fluorescent Protein e LCDs, sistema já mostrado na literatura como formador de fase líquido separada. A enzima 1,2-CCD será expressa e purificada com LCDs ligados a suas regiões N- e C-terminais, sendo tais LCDs derivados de sequências de baixa complexidade reportadas previamente na literatura e que se mostraram capazes de induzir separação de fase líquido-líquido. Para caracterizar as proteínas quimera, usaremos calorimetria diferencial de varredura (DSC), dicroísmo circular (CD) e medida da atividade enzimática. Para monitorar o processo de separação de fases, as técnicas de microscopia e de espalhamento de luz serão empregadas. Esperamos que o agregado formado por separação de fase da proteína quimera tenha potencial uso na degradação de compostos aromáticos e que o estabelecimento com sucesso do know how na produção de micro-reatores por separação de fase líquido-líquido possa ser estendido a outras enzimas com potencial aplicação biotecnológica. (AU)