Recombinação homologa mediada pelo sistema CRISPR/Cas e inserção de gene de resistência no desenvolvimento de variedades de laranjas doce resistentes ao Huanglongbing

Resumo

O uso da tecnologia de edição de genomas CRISPR/Cas tem revolucionado as pesquisas em animais, plantas e humanos. Este sistema tem sido amplamente utilizado em estudos de funções gênicas, processos biológicos e no melhoramento genético de plantas. Como ferramenta de edição de genoma, a utilização de endonucleases do tipo Cas com seus sitios catalíticos intactos resulta obrigatoriamente na ruptura da fita do DNA. Dois mecanismos de reparo podem atuar, junções das pontas não homólogas (NHEJ) e reparo direcionado por homologia (HDR). Apesar de ser um grande desafio alterar genomas via HDR, a substituição precisa de um alelo existente por um "elite" ou inserções gênicas em cultivares comerciais é um objetivo importante no melhoramento de safras. Sendo assim o presente projeto tem como objetivo estabelecer a tecnologia CRISRP/Cas pela utilização do completo sgRNA/Cas Ribonucleoproteina (RNP) via HDR. A utilização combinada do complexo RNP e HDR possibilita o melhoramento de culturas de interesse econômico sem deixar sinais de transgenia que prejudiquem ou impeçam sua comercialização. Devido ao desafio em estabelecer a técnica, o projeto propõe iniciar os experimentos em planta modelo e induzir HDR por CRISPR/Cas utilizando como DNA molde o gene RUBY, uma vez que, sua inserção gênica levará ao desenvolvimento de fenótipos alterados. Posterior ao sucesso destas etapas, variedades comerciais de citros e genes de resistência ao Huanglongbing (HLB) se tornarão os alvos deste estudo, devido aos danos econômicos que essa doença vem causando na Citricultura. No entanto, sabendo da dificuldade em estabelecer a tecnologia CRISPR/Cas - HDR para espécies vegetais, o projeto também propõe o desenvolvimento de variedades resistentes ao HLB pela utilização de técnicas de Engenharia Genética convencional, para promover superexpressão do gene Endochitinase B que foi associado a resistência ao HLB (Curtolo et al 2020). Ao final, o projeto irá contribuir para estabelecer uma tecnologia inovadora que pode ser futuramente utilizada no melhoramento de outras culturas agrícolas e ainda desenvolver variedades de citros resistentes ao HLB. (AU)