Estudo da regulação da via mitofágica em macrófagos pelo HIF-1a

Resumo

A mitofagia é o processo de eliminação de mitocôndrias defeituosas, que atua como um controle de qualidade mitocondrial - reduzindo inflamação e sinais de morte celular, além de evitar o desenvolvimento de doenças crônicas. O processo ocorre por meio da via PINK1/Parkin ou também pela via mediada por receptores, em que ambas induzem a formação de autolisossomos, onde as mitocôndrias danificadas sofrem o processo de degradação. O fator de transcrição HIF-1±, descrito como fundamental na regulação da resposta imune, demonstrou em nossos dados preliminares, estar envolvido na expressão de proteínas lisossomais - Catepsina C e LAMP1 - e mitofágicas - BNIP3. Dessa forma, o projeto tem como objetivo elucidar a influência do fator de transcrição HIF-1± na regulação da mitofagia em macrófagos, verificando sua atuação na presença e funcionalidade de lisossomos e sua influência na mitofagia, sendo ainda avaliada a funcionalidade de macrófagos diante da modulação de HIF-1±. Proteínas lisossomais serão avaliadas por qPCR, Western Blot e ensaio enzimático para verificar a abundância e atividade de lisossomos, sendo caracterizados ainda os autofagolisossomos iniciais e tardios por imunofluorescência e microscopia eletrônica. Para avaliar como o HIF-1± afeta a mitofagia em macrófagos, serão utilizados camundongos LysMcreHif1±flox, LysMcreVHLflox cruzados com animais Phamflox, sendo ainda verificadas as proteínas mitofágicas por Western Blot e microscopia confocal. O metabolismo de macrofágos será avaliado por meio da expressão de genes da via glicolítica por qPCR e citocinas serão avaliadas por citometria intracelular e ELISA. Por fim, a capacidade fagocítica de macrófagos será analisada por citometria de fluxo e CFU, sendo verificado também a resposta de macrófagos in vivo à infecção com E. coli. Com isso, espera-se determinar como o HIF-1± modula a funcionalidade de lisossomos e o processo de mitofagia em macrófagos. (AU)