EasyGuide expandido: aplicações de CRISPR em Saccharomyces cerevisiae baseadas na montagem in vivo de gRNAs e bibliotecas de oligos

Resumo

A tecnologia CRISPR abriu novas perspectivas para a reprogramação genética de organismos e tem impactado a genética molecular de Saccharomyces cerevisiae, um microrganismo chave para biotecnologia. Recentemente propomos uma nova abordagem de CRISPR (EasyGuide) baseada na recombinação eficiente de gRNAs in vivo em S. cerevisiae (ACS Synth. Biol. 2022, 11, 11, 3886-3891). O EasyGuide omite a etapa de pré-clonagem do gRNA em E. coli e, com isso, acelera os procedimentos de edições genômicas. Neste projeto propomos expandir as ferramentas EasyGuide para incluir plasmídeos compactados, apresentando maior eficiência nas aplicações CRISPR. Os novos vetores irão permitir a clonagem in vivo de bibliotecas de oligos para montagem de gRNAs usados em screenings de CRISPRi (interferência) ou CRISPRa (ativação) para tolerância de leveduras a hidrolisados de cana-de-açúcar. Como nova abordagem, plasmídeos EasyGuide remodelados irão facilitar a clonagem e recombinação genômica de bibliotecas de oligos especificando substituições de aminoácidos mimetizando fosforilações (Ser para Asp; Tre para Asp) e desfosforilações (Ser to Ala; Tre to Ala) sobre os módulos regulatórios da proteína Msn2, um fator de transcrição chave para respostas de estresse em S. cerevisiae. Com ensaios das bibliotecas MSN2-modificadas sob condições de estresse ambiental (i.e., alto teor de etanol), ou enriquecendo variantes ativadas/desativadas da Msn2 pela expressão do biosensor HSP12-GFP analisada por Fluorescence-activated cell sorting, visamos o ganho de informações sobre a regulação da proteína Msn2 e, ao mesmo tempo, a prospecção de mutações miméticas de fosfo/desfosforilação que impactem a fermentação de leveduras em condições industriais. O EasyGuide é, portanto, visto como uma ferramenta versátil auxiliando na produção de materiais e combustíveis renováveis por leveduras. (AU)