Efeito do precondicionamento isquêmico no transplante autólogo de ovários em ratas

Resumo

A lesão de isquemia e reperfusão é uma causa importante de falha no transplante de órgãos. Muitos estudos experimentais têm mostrado que o precondicionamento isquêmico tem efeito benéfico na lesão de isquemia e reperfusão em diferentes órgãos. No que diz respeito ao transplante de ovário, muitas mulheres em idade reprodutiva têm sido submetidas a tratamentos citotóxicos que invariavelmente estão associados ao prejuízo da fertilidade. Estudos experimentais mostraram que a isquemia que ocorre no transplante, prévia a revascularização, é o principal fator responsável pela perda de grande quantidade da população folicular - cerca de 35 a 50% dos folículos primordiais. Este projeto de pesquisa tem como objetivo estudar o efeito do precondicionamento isquêmico em transplantes autólogos de ovários em ratas. MÉTODO: Este projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da UNIFESP sob protocolo 1327/2006. Serão utilizadas 70 ratas adultas, Wistar EPM-1, distribuídas em 7 grupos de estudos de 10 animais cada, conforme os procedimentos realizados: Grupo Controle (GC): ooforectomia unilateral; Grupo Ooforectomia (GO): ooforectomia bilateral; Grupo Transplante a fresco (GTF): ooforectomia bilateral seguida de transplante unilateral de ovário a fresco; Grupo Transplante criopreservado (GTC): ooforectomia bilateral seguida de transplante unilateral de ovário criopreservado; Grupo Precondicionamento isquêmico (GPC): precondicionamento isquêmico; Grupo Precondicionamento isquêmico + Ooforectomia + Transplante de ovário a fresco (GPC+TF): precondicionamento isquêmico, seguido de ooforectomia bilateral e transplante de ovário a fresco; Grupo Precondicionamento isquêmico + Ooforectomia + Transplante de ovário criopreservado (GPC+TC): precondicionamento isquêmico, seguido de ooforectomia bilateral e transplante de ovário criopreservado. Os animais serão anestesiados com injeção intramuscular de cetamina e xilazina. O precondicionamento isquêmico será realizado por meio de clampeamento da artéria ovariana por um período de 10 minutos de isquemia seguidos de 10 minutos de reperfusão, conforme o grupo. Transplante de ovário a fresco: Após a ooforectomia, o ovário será imediatamente implantado, ortotopicamente ao nível do corno uterino direito. Transplante de ovário criopreservado: Nos grupos GTC e GPC+TC será realizada ooforectomia unilateral, sendo estes ovários criopreservados previamente ao transplante por um período de 24 horas, utilizando-se dimetilsulfoxide como criopreservante para posterior colocação em freezer com taxas de congelamento programadas. No grupo GPC + TC, previamente a ooforectomia, será realizado o precondicionamento isquêmico conforme padronização descrita anteriormente. Após 24h, será realizada uma segunda laparotomia nos referidos grupos para exérese do ovário contralateral remanescente e transplante do ovário criopreservado. No 2o dia de pós-operatório, a função ovariana será avaliada por meio de esfregaços a cada dois dias durante todo o experimento, para análise do ciclo estral, por meio de material obtido com instilação de solução salina a 0,9% na vagina. Os esfregaços serão analisados em lâmina padrão a fresco e coradas pelo Giemsa. Serão realizadas dosagens dos hormônios folículo-estimulante (FSH) e estradiol coletadas durante o experimento, em dias pré-estabelecidos por meio de projeto piloto. Decorridos 21 dias do transplante, será realizada nova laparotomia sobre a cicatriz anterior e, após localização do enxerto ovariano, este será ressecado e fixado no formol a 10% para estudo histológico pela Hematoxilina-Eosina. Após a coleta das peças, os animais serão submetidos à eutanásia por meio de dose letal dos medicamentos. Serão realizadas análises morfológica, morfométrica, imunohistoquímica pelo PCNA, dosagem da mieloperoxidase e avaliação da apoptose através do anticorpo anti-caspase-3 clivado e keratin 18. Os dados obtidos serão submetidos à análise estatística segundo a natureza das variáveis (AU)