Luciferases de coleópteros: evolução estrutural e funcional, e engenharia para fins biotecnológicos

Resumo

As luciferases de vagalumes sao as enzimas que produzem a bioluminescencia em organismos como vagalumes. Estão sendo amplamente utilizadas para finalidades bioanalíticas nas áreas médica (Diagnósticos, e estudos pré-clínicos de patologias como infecções bacterianas, virais e câncer), biotecnológica (biosensores luminescentes) e ambiental (biosensores de toxicidade). Todas estas aplicações utilizam umas poucas luciferases oriundas dos vagalumes Norte-americano, europeu e japoneses que produzem luz verde-amarela e são sensitivas ao pH. Nosso grupo de pesquisa clonou ao longo dos ultimos anos várias luciferases de besouros brasileiros, dentre as quais luciferases únicas que produzem luz vermelha de Phrixotrix hirtus e verde-azulada de Pyrearinus termitilluminans, e luciferases pH-sensitivas de Macrolampis e Cratomorphus distinctus. Através de mutagênese sítio-dirigida, modelagem, e estudos funcionais, demonstramos que o loop entre os residuos 223-235 desempenha um papel essencial na detrminação dos espectros de bioluminescência. A interação deste loop com os resíduos E311 eR337 são aparentemente responsáveis pela manutenção de uma conformação apropriada do sítio-ativos das luciferases, responsável pela emissão de luz verde-amarela. Estudos físico-químicos indicam que o sítio ativo das luciferases verde é mais hidrofóbico que aquele da luciferase vermelha. Entretanto, ainda não conseguimos determinar que resíduos estão especificamente envolvidos com as mudanças dos espectros de bioluminescência e com a sensibilidade ao pH. Através de estudos de mutagênese sítio-dirigigida, modelagem, caracterização físico-química destas luciferases, pretendemos identificar os resíduos importantes para as cores de bioluminescência nas luciferases de Phrixotrix e Pyrearinus, e sensibilidade ao pH nas luciferases de Macrolampis e Cratomorphus. Além disto, através de mutagênse sítio-dirigida e randomica, pretendemos estabilizar estas luciferases quanto a temperatura e cinética, para torná-las mais apropriadas par fins biotecnológicos, especificamente para uso como reagente bioanalíticos e como genes repórter para células de mamíferos. Também estaremso tentando determinar as estruturas tridimensionais em colaboração com o Prof. Joao Barbosa (LNLS, Campinas). (AU)