Modificações pós-traducionais (PTMs) da glicoproteína de superfície GP82, a principal adesina das formas metacíclicas de Trypanosoma cruzi

Resumo

As modificações pós-traducionais (PTM) são processos que podem alterar o tamanho, composição, função e/ou localização das proteínas. Entre elas, a adição de âncora de glicosilfosfatidilinositol (GPI) altera o tamanho e composição das proteínas pela clivagem das extremidades amino- e carboxi-terminal. Estas modificações são bastante conservadas entre eucariotos, ocorrem co-traducionalmente no retículo endoplasmático, onde uma peptidase reconhece o peptídeo sinal remove a extremidade amino-terminal da proteína nascente e a transamidase cataliza a clivagem/adição da âncora GPI na extremidade carboxi-terminal.A glicoproteína GP82, presente nas formas metacíclicas infectivas de Trypanosoma cruzi, é uma adesina estágio-específica inserida na superfície celular por âncora de GPI que tem papel preponderante nos processos de adesão/invasão do parasita na célula hospedeira. Análises in silico da proteína GP82 permitiram a identificação de putativos sítios de clivagem e processamento nas extremidades amino- e carboxi-terminal, mas até a presente data, tais predições não foram confirmadas experimentalmente.Muitos dos fatores de virulência de T. cruzi (TS, GP82, GP90 e mucinas) estão ancorados na membrana plasmática via GPI. O presente trabalho visa determinar experimentalmente as regiões envolvidas na modificação pós-traducional de adição de âncora GPI, que gera as extremidades amino- e carboxi-terminal da proteína GP82 madura, principal adesina das formas metacíclicas de T. cruzi. A estratégia a ser utilizada consiste na transfecção de T. cruzi com diferentes construções que expressam a proteína GP82 contendo um epítopo (c-myc) ou em fusão com a proteína verde fluorescente (GFP). A distribuição destas proteínas quiméricas será analisada por microscopia óptica e eletrônica e fracionamento bioquímico. Os peptídeos gerados serão analisados por espectrometria de massa e degradação de Edman.Muitos membros da superfamília TS e de outras famílias de proteínas GPI-ancoradas como GP63, MASP e mucinas de T. cruzi apresentam significativo grau conservação nas regiões amino- e carboxi-terminal. Como os sinais envolvidos na ancoragem por GPI encontram-se principalmente nas regiões amino- e carboxi-terminal, os protocolos aqui descritos para análise da GP82 poderão ser aplicados aos outros membros da superfamília TS e de outras famílias de proteínas GPI-ancoradas de T. cruzi.