Identificação e produção de anticorpos contra proteínas sexo específicas do espermatozóide bovino

Resumo

A sexagem de espermatozoides, para a obtenção de doses de sêmen com alta porcentagem de gametas portadores do cromossomo X ou Y, torna ainda mais relevante o papel da inseminação artificial na maximização do progresso genético entre gerações; na produtividade e retorno econômico em algumas atividades pecuárias; na reprodução assistida em mamíferos; e no aconselhamento genético da espécie humana. Assim, os objetivos, do presente projeto serão estudar um método mais adequado para solubilização das proteínas da membrana plasmática de espermatozoides; separar por eletroforese 2D-DIGE as proteínas da membrana de espermatozoides contendo os cromossomos X ou Y de bovinos a fim de selecionar proteínas sexo-específicas; identificar os resíduos de aminoácidos das proteínas de interesse pela espectrometria de massa; produzir anticorpos sexo-específicos pela imunização heteróloga (galinhas); e verificar a eficiência da ligação desses anticorpos aos espermatozoides bovinos. Serão testados 3 protocolos de solubilização das proteínas espermáticas em amostras de sêmen convencional: 1) Nonidet P-40, 2) RIPA modificado; 3) uréia e tiouréia, associados ou não a congelação e descongelação das amostras em nitrogênio líquido e sonicação. O protocolo que separar um maior número de spots será selecionado para a preparação das amostras de sêmen sexado. Serão utilizadas doses comerciais de espermatozoides sexados para a separação por eletroforese 2D-DIGE utilizando-se as sondas Cy2, Cy3 e Cy5. Os spots diferenciais serão excisados dos géis para espectrometria de massa e inoculação em galinhas poedeiras, para produção de anticorpos a partir da gema de ovo. Os anticorpos serão purificados por cromatografia líquida e testados quanto à eficiência de ligação em 50% das células de um ejaculado não sexado utilizando-se a citometria de fluxo, a qual verificará a ligação do anticorpo anti-proteínas de interesse. (AU)