Caracterização das diferenças estruturais e funcionais do proteassomo 20s da levedura Saccharomyces cerevisiae após mutações sítio-específicas de seus resíduos de Cys modificados por S-glutatiolação

Resumo

O proteassomo é um complexo multicatalítico e multimérico que faz parte do sistema ubiquitina-proteassomo (UPS). O proteassomo é constituído de uma unidade catalítica denominada 20S (20SPT), associada ou não a unidades regulatórias sendo a 19S a mais abundante. Quando associado à unidade 19S forma o complexo denominado de 26S (26SPT). Este complexo é o responsável pela degradação de proteínas reguladas pelo processo de poliubiquitinação envolvidas na regulação do ciclo e sinalização celular, apresentação antigênica e controle da síntese proteica. No entanto, proteínas oxidadas são degradadas pelo 20SPT mesmo na ausência de unidades regulatórias e independentemente da modificação com poliubiquitina e do consumo de ATP. O aumento da hidrofobicidade devido à oxidação parece facilitar a interação dessas proteínas com o 20SPT. A remoção de proteínas oxidadas pelo 20SPT é uma importante defesa intracelular e preventiva da formação de agregados proteicos. O 20SPT é formado por quatro anéis heptaméricos na seguinte ordem ±²²±. Seus sítios catalíticos localizam-se em três das subunidades ² e os heptâmeros ± são responsáveis pela regulação da abertura e fechamento da câmara catalítica. Dentre as modificações pós-traducionais que o 20SPT sofre, a glutatiolação regula a abertura do anel ±. A forma glutatiolada do 20SPT degrada mais eficientemente proteínas oxidadas quando comparada à reduzida devido à abertura da câmera catalítica. Como demonstrado por Silva e colaboradores (2012), dois resíduos de Cys, dentre 32 Cys presentes na estrutura do 20SPT da levedura Saccharomyces cerevisiae, foram encontrados glutatiolados em preparações do 20SPT purificado de leveduras crescidas até a fase estacionária em meio de glicose. Os objetivos do presente projeto são avaliar o fenótipo e a capacidade de remoção de proteínas oxidadas de linhagens de levedura mutantes pela substituição dos resíduos de Cys glutatioláveis do 20SPT, aqueles encontrados previamente glutatiolados (C76 e C221 da subunidade ±5) e caracterizar as diferenças estruturais e funcionais do 20SPT apresentando essas mutações. (AU)