Estudo funcional da interação entre a proteína disulfeto isomerase (PDI) e a proteína ligante de actina, Profilina 1

Resumo

A proteína disulfeto isomerase A1 (PDI), uma chaperona do retículo endoplasmático emerge como novo regulador de processos de sinalização redox envolvendo as NADPH oxidases NOX. Evidencias recentes de nosso grupo sugerem que os mecanismos destes efeitos envolvem uma convergência direta entre PDI e RhoGTPases como Rac1 e sua chaperona RhoGDI±. Neste contexto, PDI e proteínas relacionadas atuam como reguladores da dinâmica do citoesqueleto. Utilizando analise proteômica, nós identificamos outra proteína potencialmente envolvida nestas interações, a proteína ligante de actina, profilina-1 (PFN1). Os experimentos necessários para avançar no entendimento da relevância funcional da interação PDI/PFN1 in vivo (com possibilidades de interações adicionais com actina e Rac1) requerem ferramentas que não estão disponíveis e/ou não são inteiramente dominadas por nosso grupo. Algumas destas técnicas incluem microscopia confocal de alta resolução (high-resolution confocal microscopy), FRET e FLIM. Além disso, ensaios complementares de polimerização de actina in vitro e outros experimentos biofísicos são propostos com intuito de analisar e confirmar a formação destes complexos. O objetivo principal desta bolsa BEPE é validar e analisar o padrão da interação PDI/PFN1 em modelo(s) fisiologicamente relevante(s) envolvendo estudos de dinâmica do citoesqueleto na migração de células endoteliais. Assim, nossos objetivos específicos são: 1) investigar as implicações funcionais da interação entre PDI e PFN1 utilizando ensaios de ganho e perda de função, em modelo de migração celular de células endoteliais; 2) analisar a interação direta entre PDI e PFN1 em células vivas utilizando ferramentas de microscopia confocal; 3) Estudar os efeitos da interação PDI/PFN1 sobre a polimerização de actina in vitro; 4) determinar in vitro, os parâmetros bioquímicos e biofísicos desta interação proteica por medidas de calorimetria e ultracentrifugação analítica. Todos estes experimentos contribuirão para o avanço na caracterização molecular de um modelo de controle da dinâmica do citoesqueleto pela PDI, com consideráveis implicações fisiológicas. (AU)