Identificação de RNAs regulatórios em resposta à disponibilidade de ferro e seus mecanismos de ação em Caulobacter crescentus

Resumo

Os pequenos RNAs não codificantes com função regulatória (sRNAs) podem agir sobre a tradução de uma proteína codificada por um mRNA alvo, favorecendo ou impedindo a formação de estruturas secundárias no mRNA de modo a permitir ou não o livre acesso dos ribossomos ao RBS do gene. Por fim, os sRNAs podem ainda alterar a estabilidade do RNA mensageiro de modo a torná-lo mais estável ou instável. Uma análise global do transcriptoma realizado em nosso laboratório identificou genes de C. crescentus cuja expressão era dependente de Fur em resposta a ferro, mas também um grupo de genes diferencialmente expressos em resposta à disponibilidade de ferro cuja expressão não depende do regulador Fur. Estes resultados pressupõem a existência de um segundo regulador, que como descrito para outros organismos provavelmente é um RNA regulatório, e até o momento não foi descrito um sRNA nesta bactéria envolvido na homeostase de ferro.Este projeto propõe a identificação de pequenos RNAs não codificantes de função regulatória em situação de carência de ferro, através da análise global por sequenciamento de RNA total (RNAseq). Esta abordagem permite a identificação de genes diferencialmente expressos com maior sensibilidade que os microarranjos de DNA. Uma vez identificados os RNAs regulatórios induzidos em carência de ferro, novos experimentos de RNAseq serão realizados, desta vez utilizando a linhagem mutante nula para o sRNA, com o intuito de identificar seus alvos de regulação pós-transcricional. Seus alvos de regulação em nível traducional serão identificados por meio de espectrometria de massa dos extratos de proteínas. Por fim, seus mecanismos regulatórios serão determinados utilizando linhagens mutantes nulas ou mutantes condicionais para as ribonucleases RNase E, RNase R, RNase III, PNPase e Hfq.