Desenvolvimento de um modelo de terapia gênica para angioedema hereditário baseado na edição do gene SERPING1 pelo sistema CRISPR-Cas9

Resumo

O angioedema hereditário (AEH) é uma doença genética rara decorrente da deficiência do inibidor de C1 (C1-INH), que corresponde ao AEH tipos I e II, mais recorrentes na população, ou de mutações no gene F12. Ambas as alterações levam à ativação descontrolada do sistema calicreína-cininas (KKS) culminando em liberação excessiva de bradicinina (BK). O AEH afeta profundamente a qualidade de vida, seu tratamento é caro e muitas vezes ineficiente. Propomos um modelo de terapia gênica baseado na correção do gene que codifica o C1-INH (SERPING1). Primeiramente, produziremos linhagens de camundongos e células com a mutação correspondente à p.A297T, encontrada em famílias brasileiras com AEH, por meio do sistema CRISPR-Cas9. A mutação gerada em SERPING1 será posteriormente corrigida pelo mesmo sistema CRISPR-Cas9. O plasmídeo pSpCas9 nickase (pSpCas9n) será utilizado para gerar camundongos deficientes em C1-INH por microinjeção em pró-núcleos de embriões de animais C57BL/6N. A edição gênica será avaliada por sequenciamento, quanto a formação de indels por SURVEYOR e quanto a formação de off-targets por sequenciamento de nova geração e BLESS. Paralelamente, ensaios in vitro do protocolo de correção gênica serão realizados. A caracterização dos animais será feita pela dosagem quantitativa e funcional de C1-INH, assim como inferência da permeabilidade vascular. Poderemos então iniciar os primeiros testes de um protocolo in vivo de correção de SERPING1 por injeção hidrodinâmica das construções corretoras na veia caudal dos animais.