Estudos de Cryo-EM sobre os sistemas de secreção Tipo IV Xanthomonadaceae

Resumo

Bactérias utilizam diferentes sistemas de secreção para translocar macromoléculas através do envelope celular. O Sistema de secreção do tipo IV (T4SS) do fitopatógeno Xanthomonas citri é responsável pela secreção de toxinas que matam outras bactérias Gram-negativas. Os T4SSs são sistemas supramoleculares, formados por dois subcomplexos, o complexo principal (~ 1 MDa) e o complexo da membrana interna. Estudos de microscopia eletrônica de partículas únicas realizados em nosso grupo mostram que o complexo principal do T4SS de X. citri é formado por 14 repetições do heterotrímero VirB7-VirB9-VirB10, formando um anel tetradecamérico. Cada uma dessas subunidades pode ser subdividida em um domínio N-terminal e outro C-terminal (B7NT, B7CT, B9NT, B9CT, B10NT, B10CT). A única densidade disponível para o domínio N-terminal de VirB10 (previsto para ser intrinsecamente desordenado) corresponde a uma hélice composta pelos resíduos 150-161. O anel tetradecamérico pode ser dividido em duas camadas, a camada superior, associada à membrana externa, corresponde a B7NT, B7CT, B9CT e B10CT, enquanto que a camada inferior corresponde a B9NT e B10NT. Dentro de cada camada as interações entre os domínios de cada subunidade são fortes. Por outro lado, as interações entre as camadas superior e inferior são aparentemente fracas, e ambas estão conectadas por segmentos flexíveis entre os domínios N- e C-terminal de VirB9 e VirB10. Além disso, as interações entre B7CT com o corpo principal da camada superior também são tênues. Essas observações sugerem que o complexo principal é intrinsecamente dinâmico, e que o que estamos observando é provavelmente apenas uma das múltiplas possíveis conformações disponíveis para o complexo principal. Movimentos intra-subunidades, inter-subunidades, e inter-camadas, em varias escalas de tempo, podem ser essenciais para o funcionamento deste sistema. Portanto, para obter informação sobre a dinâmica do complexo principal de X. citri, planejamos realizar simulações de dinâmica molecular (MD em inglês) usando a nossa estrutura como ponto de partida. As simulações moleculares serão complementadas por estudos de Crio-microscopia eletrônica. Uma vez que Cryo-EM preserva a heterogeneidade conformacional das moléculas em estudo (após o congelamento rápido em gelo amorfo), talvez seja possível obter informações estruturais acerca diferentes estados conformacionais disponíveis para a proteína em solução. Esses estados conformacionais poderão ser detectados por classificação 3D de partículas inteiras ou por classificação 3D focada de domínios específicos. Planejamos utilizar esta ultima técnica de classificação focada para detectar a heterogeneidade conformacional entre os trímeros quimicamente idênticos VirB7-VirB9-VirB10 no complexo principal.