Construção de células fluorescentes para estudar diversos processos celulares em células tumorais vivas

Resumo

A resistência a terapia no câncer é gerada por poucas células que se comportam de forma diferente da maioria das células que são eliminadas pelas terapias tradicionais. Isto significa que para entender mecanismos de resistência é necessário investigar processos em células individuais vivas. Diversas abordagens permitem fazer isto utilizando células que expressam estavelmente proteínas fluorescentes, como indicadores de estados de ativação de vias de sinalização, processos celulares como dano e reparo no DNA, autofagia, apoptose, estresse de retículo, estágio do ciclo celular e senescência entre outros. Os grupos de pesquisa proponentes deste projeto têm experiência em estudar estes processos em células tumorais, em grande parte utilizando média de populações celulares. Resultados anteriores dos nossos grupos indicaram que analisar mais que um processo em células únicas mostrou que relações inferidas por experimentos populacionais não são confirmadas em células individuais e que neste comportamento individual estão inferências biológicas importantes para compreender o processo de resistência. O objetivo geral deste projeto é construir linhagens celulares contendo marcadores fluorescentes de vias de sinalização e processos celulares importantes na sobrevivência de células tumorais à terapia. Estas células serão utilizadas pelos grupos proponentes e demais grupos de pesquisa interessados para estudar processos celulares em diversos tipos tumorais. A estratégia de ação é produzir células que expressem estavelmente os marcadores de interesse utilizando transdução lentiviral e retrotransposons. Combinações de três mar-cações diferentes serão produzidas em linhagens de glioma, câncer de mama, câncer de próstata e melanomas. Será produzido uma combinação de marcações fluorescentes para cada grupo de pesquisa e este grupo irá caracterizar este tipo de marcação. Considerando que a maioria dos quimioterápicos induzem danos ao DNA, os processos celulares estão focados em dano e reparo de DNA e suas consequências sobre a célula como autofagia, senescência, estresse de retículo, estresse mitocondrial e parada no ciclo celular bem co-mo na transição epitélio-mesenquimal. As investigações mecanísticas serão conduzidas por 5 grupos de SP e por 7 grupos do RS. Outros 3 grupos do RS darão apoio na detecção automática das células através de aprendizado de máquina, avaliação estatística dos resultados e modelagem das redes de sinalização que controlam estes processos. A execução deste projeto permitirá a geração de um banco de plasmídeos e células caracterizadas para uso biotecnológico em diagnóstico e desenvolvimento de estratégias terapêuticas. A rede de colaboração já está bem estabelecida entre os grupos do RS e de SP, com diversos artigos publicados em colaboração ao longo de mais de 10 anos. A rede de colaboração do RS envolve na sua maioria colaborações bem estabelecidas além de uma pro-posta de colaboração nova para a modelagem dos dados encontrados em células individuais. A rede paulista envolve grupos estabelecidos com colaborações já em andamento As áreas envolvem principalmente biotecnologia, biologia molecular e celular e medicina, mas estrategicamente incluem também estatística, informática e física para a detecção e análise dos resultados encontrados. O impacto esperado é que estas ferramentas possam ser utilizadas pelos grupos proponentes e outros grupos de pesquisa para entender o funcionamento e integração entre vias de sinalização e processos celulares em células individuais para o estudo de diversos mecanismos, principalmente o de resistência de células tumorais a terapia. Adicionalmente, este projeto permitirá consolidar melhor as interações entre os grupos de pesquisa envolvi-dos, ampliando a qualidade da pesquisa já realizada por estes. (AU)