Caracterização dos sítios de interação no genoma do lincRNA PVT1 associado ao receptor de andrógeno em linhagem de Câncer de Próstata

Resumo

O receptor de andrógeno (AR) é um fator de transcrição que medeia o efeito do hormônio andrógeno e modula o programa de transcrição gênica em células da próstata. Pouco se sabe sobre a interação dos RNAs longos intergênicos não-codificadores (lincRNAs) com fatores de transcrição, especialmente na regulação de eventos complexos tais como o programa de regulação de genes induzido pelo fator de transcrição AR em células LNCaP. Em um trabalho publicado em 2018, observamos que entre os mais de 600 lincRNAs ligados ao AR em células de Câncer de Próstata LNCaP estava o PVT1, um lincRNA oncogênico, que está sabidamente aumentado em diversos tipos de Câncer, inclusive de próstata. Sabe-se que o lincRNA PVT1 se liga a EZH2, uma subunidade do Polycomb Repressor Complex 2 (PRC2) e isso leva à inibição da transcrição de alguns genes codificadores de proteínas em certos tipos de Câncer. Contudo, até agora não se havia estudado o efeito do lincRNA PVT1 sobre a regulação de genes em larga-escala em um mesmo tecido. Dados recentes de nosso laboratório, ainda não publicados, obtidos pelo doutorando Alexandre Videira, mostram que o Knock-Down (KD) de PVT1 em células LNCaP em cultura, na presença de andrógeno, afeta significativamente (q-value < 0,01) a transcrição de centenas de genes alvo, e mostram que dezenas de genes inibidos por andrógeno podem ter a expressão restaurada parcialmente, totalmente restaurada ou até superativada após o silenciamento do lincRNA PVT1. Esses dados confirmam o papel do lincRNA PVT1 como um modificador da transcrição, funcionando como um inibidor da transcrição de genes alvos, possivelmente através da formação de um complexo lincRNA PVT1-AR-PRC2. Na proposta atual, vamos usar ChIP-Seq para imunoprecipitar a marca de histona H3K27me3 seguido do sequenciamento em larga-escala do DNA genômico co-imunoprecipitado, em células LNCaP controle ou com silenciamento de PVT1. Espera-se mapear os sítios genômicos dos genes alvo de AR e PVT1, onde deve haver diminuição da deposição da marca H3K27me3 quando o PVT1 é silenciado, deixando de recrutar EZH2 para aqueles sítios. Faremos ChIP-Seq com anti-EZH2, para confirmar que houve diminuição da ocupação dos sítios por EZH2 quando PVT1 é silenciado. Faremos também o mapa da ocupação do lincRNA PVT1 ao longo do genoma, e esperamos revelar todos os sítios de interação do PVT1 com a cromatina em LNCaP, usando o método "Chromatin Isolation by RNA purification" (ChIRP) que foi empregado pela primeira vez para mapear os sítios de ligação no genoma do lincRNA HOTAIR e do complexo Polycomb. Além de sequenciar o DNA genômico capturado, faremos a análise por espectroscopia de massa (MS) das proteínas capturadas no ensaio ChIRP, e que fazem parte do complexo lincRNA:cromatina:proteína, e esperamos revelar os outros parceiros protêicos do lincRNA PVT1, além de EZH2. (AU)