Mecanismos de resposta a estresses oxidativo na fosforilação de eIF2± e de AMPK no T. cruzi

Resumo

Neste projeto avaliaremos em T. cruzi o papel da fosforilação de eIF2± na resposta a diferentes estresses e a ativação de AMPK, sensor do estado energético das células. Durante o estresse nutricional eIF2± é fosforilado, diminuindo a síntese proteica e levando a diferenciação para a forma infectiva do parasito. Estresse oxidativo e baixos níveis de heme também causam a fosforilação de eIF2± pela quinase TcK2. Em nosso grupo obtivemos T. cruzi com mutação de eIF2± em que a treonina T169 foi substituída por alanina usando CRISPR-Cas9. Estes parasitos não foram capazes de fosforilar eIF2, tornando-os mais suscetíveis a estresse induzido por água oxigenada. Também já verificamos que proteína quinase AMPK, que é um sensor de níveis de nutrientes e de estresses oxidativo, é fosforilada tanto em estresses oxidativo como na falta de nutrientes no T. cruzi. Após a fosforilação, se detectam componentes de maior massa molecular e que poderiam corresponder a ubiquitinação das cadeias da AMPK. Esta enzima em outros eucariotos pode ser ativada pela proteína quinase CamKII quando há acúmulo de cálcio nas células ou quando há presença de ROS e derivado de heme, e se verificou que estes processos estão relacionados com a proliferação dos parasitas na forma epimastigota. Em nosso grupo também obtivemos parasitos com Tag de mNeonGreen no N-terminal em AMPK±1 e ±2 pelo sistema CRISPR-Cas9 que serão utilizados para os experimentos de estresse. Assim, pretendemos verificar como ocorre a fosforilação de eIF2± e de AMPK em condições de estresse oxidativo e qual a importância destes processos para a sobrevivência e diferenciação do parasita. Para isto pretendemos: 1) determinar a susceptibilidade ao estresse oxidativo induzidos por agentes oxidantes e nitroso ativos nos parasitas modificados em eIF2± e de parasitas nocaute para a TcK2, ambos já obtidos no laboratório, comparados com parasitas não modificados; 2) determinar o efeito dos mesmos agentes na fosforilação das cadeias de AMPK ±1 e ±2, em comparação com alterações na relação ATP/ADP/AMP em cada situação; 3) identificar enzimas envolvidas na fosforilação de AMPK utilizando inibidores farmacológicos de CamKII ou alterando os níveis de Ca2+ intracelular do parasita; 4) verificar se as vias de sinalização para a fosforilação de eIF2± estão relacionadas com a ativação de AMPK utilizando os parasitas mutantes eIF2±/T169A. Este estudo permitirá entender como o parasita responde a situações enfrentadas durante o ciclo de vida. (AU)