Estudo dos neurônios entéricos e células gliais entéricas na Colite Ulcerativa Experimental Crônica em camundongos deficientes para o receptor P2X7 (P2X7R-/-)

Resumo

As doenças inflamatórias intestinais (DII) é um termo usado para descrever a inflamação prolongada do trato gastrintestinal, inclui a Doença de Crohn (DC) e a Colite Ulcerativa. A Colite Ulcerativa afeta os neurônios entéricos e causa uma inflamação da mucosa de forma contínua, estendendo-se do reto ao colo proximal. O receptor P2X7 (P2X7R) é ativado por níveis aumentados de ATP extracelular na inflamação intestinal e ativa o inflamassoma NLRP3. O receptor P2X7 participa na regulação da resposta inflamatória através do processo de liberação de citocinas pró-inflamatórias, como IL-1², IL-18 e TNF-alfa. O objetivo deste projeto é analisar neurônios entéricos e células gliais entéricas na colite ulcerativa experimental crônica em camundongos deficientes para o gene do receptor P2X7 (P2X7R-/-, P2X7RKO) e C57BL/6 Wild Type (WT). Para isto, os camundongos deficientes para o receptor P2X7 (P2X7R-/-) e WT C57BL/6 receberão 2% (2g/100ml) de dextran sulfato de sódio (DSS) dissolvido em água potável por 5 dias seguido de água potável pelos próximos 14 dias. Os animais receberão 3 ciclos de DSS. Serão realizadas as técnicas de duplas e triplas marcações de imunofluorescência com o objetivo de analisar a) a dupla marcação do P2X7R com neurônios óxido nítrico sintase neuronal (NOSn), Calretinina (Carl), à Calbindina (Calb), ao receptor TNF1 (TNFR1), TNF-alfa, ao fator de transcrição NF-k², à Caspase 3 clivada, ao NLRP3 e ao marcador de célula glial GFAP; b) O número e a área de neurônios/gânglio imunorreativo (ir) ao NOSn, Calr, Calb; c) para a análise morfológica do intestino grosso será usado o método de histologia convencional; d) para a averiguação da motilidade intestinal será usado o sistema de banho de órgãos; e) para analisar a apoptose e/ou necrose, será feito o método de TUNEL; f) Para o estudo de vias de sinalização, será feito Western Blotting do receptor P2X7, receptor TNF1 (TNFR1), ao fator de transcrição NF-k², à Caspase 3 clivada e o NLRP3; g) para o estudo das citocinas TNF-alfa e IL-1B será utilizado o método de Elisa. (AU)