Termolisina de Leptospira interrogans renaturada em alta pressão e pH alcalino mostra atividade proteolítica contra C3 do complemento.

• Processo: 18/18620-9
• Modalidade de apoio: Auxílio à Pesquisa - Publicações científicas - Artigo
• Data de Início da vigência: 01 de outubro de 2018
• Data de Término da vigência: 31 de março de 2019
• Área do conhecimento: Ciências Biológicas - Bioquímica - Química de Macromoléculas
• Pesquisador responsável: Ligia Ely Morganti Ferreira Dias
• Beneficiário: Ligia Ely Morganti Ferreira Dias
• Instituição Sede: Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares (IPEN). Secretaria de Desenvolvimento Econômico (São Paulo - Estado). São Paulo , SP, Brasil
• Assunto(s): Corpos de inclusão Alta pressão
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: alta pressao | Corpos de inclusão | pH alcalino | Renaturação | Thermolysin | Renaturação de proteínas

Resumo

Enzimas da família das termolisinas são fatores cruciais na patogênese de várias doenças causadas por bactérias e são alvos potenciais para intervenções terapêuticas. A termolisina codificada pelo gene LIC13322 do agente causador da leptospirose, Leptospira interrogans, é capaz de clivar proteínas do Sistema do complemento. No entanto, a produção desta proteína recombinante usando processos tradicionais de renaturação com altos níveis de reagentes desnaturantes para solubilização de corpos de inclusão de termolisina (TL-IBs) resulta em baixa recuperação e baixa atividade proteolítica, provavelmente devido ao enovelamento inadequado da proteína. Com base no pressuposto de que proteases leptospirais desempenham um papel crucial durante a infecção, o objetivo deste trabalho foi obter uma termolisina recombinante funcional para futuros estudos sobre o papel dessas metaloproteases na infecção por leptospirose. A associação de alta pressão hidrostática (HHP) e pH alcalino foi utilizada para a renaturação da termolisina. A incubação de uma suspensão de TL-IBs em HHP e um pH de 11,0 não é desnaturante, mas é eficaz para a solubilização de termolisina. A proteína solúvel não reagrega quando submetida a diálise em pH 8,0. Obteve-se um rendimento volumétrico de 46 mg de termolisina / L de cultura bacteriana e um rendimento de cerca de 100% em relação à termolisina total presente em TL-IB. Termolisina purificada por cromatografia de exclusão molecular sofre fragmentação, provavelmente devido a autoproteólise e apresenta atividade proteolítica contra a cadeia C3 do complemento, possivelmente por uma geração de uma molécula semelhante a C3b. A atividade proteolítica da termolisina contra C3 foi tempo e dose dependente. A experiência adquirida neste estudo ajudará a estabelecer processos eficientes baseados em HHP para redobragem de proteínas bioativas de IBs. (AU)