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Desenvolvimento do processo de produção de DNA polimerases com elevada qualidade e processividade

Processo: 17/12334-1
Linha de fomento:Auxílio à Pesquisa - Pesquisa Inovativa em Pequenas Empresas - PIPE
Vigência: 01 de dezembro de 2018 - 30 de novembro de 2020
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Bioquímica - Biologia Molecular
Pesquisador responsável:Amanda Bernardes Muniz
Beneficiário:Amanda Bernardes Muniz
Empresa:Cellco Biotec do Brasil Ltda
Município: São Carlos
Pesq. associados: Larissa Consani Textor ; Maria Amélia Villela Oliva Dotta ; Naiara Utimura Torres
Vinculado ao auxílio:16/00863-7 - Desenvolvimento do processo de produção de DNA polimerases com elevada qualidade e processividade, AP.PIPE
Assunto(s):Reação em cadeia por polimerase (PCR)  DNA polimerase dirigida por DNA  Enzimas  Reagentes 

Resumo

As DNA polimerases são enzimas envolvidas na síntese de DNA através da adição de desoxirribonucleotídeos a partir de DNA molde. É uma enzima amplamente empregada na manipulação in vitro do DNA, incluindo clonagem, sequenciamento e mutagêneses, entre outras técnicas. Mais especificamente, a DNA polimerase de Thermus aquaticus (Taq DNA polimerase) é a enzima termoestável mais utilizada atualmente e suas aplicações transcendem o uso em pesquisa, a exemplo do crescente emprego nas áreas de genotipagem e diagnóstica. Embora seja considerado reagente básico para muitas aplicações biotecnológicas, o mercado brasileiro é ainda dependente de importações de DNA polimerases, obtendo-as com preços e prazos de entrega desfavoráveis. A Taq DNA polimerase recombinante, produzida em E. coli, pode ser obtida por expressão heteróloga e apresenta as características bioquímicas idênticas as das proteínas nativas de Thermus aquaticus, como atividade, especificidade e termoestabilidade preservadas. Entretanto, estudos recentes apontam a presença de DNA microbiano e inibidores da reação de PCR em preparações dessas enzimas, até mesmo comerciais. Este é um dos desafios para sua produção e habilitação para qualquer emprego tecnológico. Adicionalmente à otimização da produção dessas enzimas, elas são alvos de projetos de engenharia de proteínas que visam melhorias em suas características funcionais. Dentre elas, a adição de certos domínios proteicos pode resultar em polimerases mais processivas. Assim, essa segunda fase do projeto busca o desenvolvimento e escalonamento do processo produtivo de obtenção da enzima Taq DNA Polimerase nativa e de sua versão otimizada e mais processiva, para a exploração comercial no mercado nacional. Durante a fase I do projeto PIPE, a enzima Taq DNA Polimerase nativa foi obtida com alto rendimento e pureza, com sua atividade testada e as amostras qualificadas como livres de contaminantes microbianos, portanto, adequada para a segunda fase do projeto, enquanto que a enzima geneticamente manipulada e mais processiva já está em processo de produção para também ter a sua caracterização funcional e avaliação da qualidade das amostras. As etapas envolvidas neste Projeto consistem em: i. aumento do volume de produção das enzimas de escala laboratorial para escala piloto e otimização de sua purificação nesta escala; ii. Caracterização bioquímica das enzimas produzidas e comparação com as demais polimerases disponíveis; iii. validação da estabilidade, integridade e reprodutibilidade do processo de produção em escala piloto; iv. estabelecimento de POPs (Procedimento Operacional Padrão) de produção e controle de qualidade, para assegurar a reprodutibilidade em todos os passos de produção. Para esta segunda fase, espera-se obter a enzima com as mesmas características obtidas, e validades pelos ensaios bioquímicos, em pequena escala. De modo geral este projeto insere-se no contexto da empresa de desenvolvimento e nacionalização da produção de reagentes básicos de biologia molecular, diminuindo custos e tempo de comercialização, fatores essenciais para o fortalecimento e competitividade da pesquisa no Brasil. (AU)