Desenvolvimento do processo de produção de DNA polimerases com elevada qualidade e processividade

• Processo: 19/00486-7
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Pesquisa Inovativa em Pequenas Empresas - PIPE
• Data de Início da vigência: 01 de dezembro de 2018
• Data de Término da vigência: 31 de janeiro de 2021
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Bioquímica - Biologia Molecular
• Acordo de Cooperação: FINEP - PIPE/PAPPE Subvenção
• Pesquisador responsável: Amanda Bernardes Muniz
• Beneficiário: Amanda Bernardes Muniz
• Empresa: Cellco Biotec do Brasil Ltda
• CNAE: Pesquisa e desenvolvimento experimental em ciências físicas e naturais
• Vinculado ao auxílio: 17/12334-1 - Desenvolvimento do processo de produção de DNA polimerases com elevada qualidade e processividade, AP.PIPE
• Assunto(s): Proteínas Enzimas DNA polimerase dirigida por DNA DNA recombinante
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Biologia molecular | DNA polimerase | enzima | processividade | Produção de proteínas por tecnologia de DNA recombinante

Resumo

As DNA polimerases são enzimas envolvidas na síntese de DNA através da adição de desoxiribonucleotídeos, de acordo com um molde. É uma enzima amplamente empregada na manipulação in vitro do DNA, incluindo clonagem, sequenciamento e mutagêneses, entre outras técnicas. Mais especificamente, a DNA polimerase de Thermus aquaticus (Taq DNA polimerase) é a enzima termoestável mais utilizada atualmente e suas aplicações transcendem o uso em pesquisa, a exemplo do crescente emprego nas áreas de genotipagem e diagnóstica. Embora seja considerado um reagente básico para muitas aplicações biotecnológicas, o mercado brasileiro é ainda dependente de importações de DNA polimerases, obtendo-as com preços e prazos de entrega desfavoráveis. A Taq DNA polimerase recombinante, produzida em E. coli, pode ser obtida por protocolos simplificados e apresenta ainda as características bioquímicas idênticas as das proteínas nativas de Thermus aquaticus, com atividade, especificidade e termoestabilidade preservadas. Entretanto, estudos recentes apontam a presença de DNA microbiano na maioria das preparações dessas enzimas, até mesmo comerciais. Isso é um dos principais fatores limitantes para a sua produção, uma vez que a Taq Polimerase é muito empregada na técnica de PCR para uso na detecção de DNA microbiano em amostras de ambiente ou de interesse médico. Adicionalmente à otimização da produção dessas enzimas, elas são alvos de projetos de engenharia de proteínas que visam melhorias em suas características funcionais. Dentre elas, a adição de certos domínios proteicos pode resultar em polimerases mais processivas. Assim, essa segunda fase do projeto busca o desenvolvimento e escalonamento do processo produtivo de obtenção da enzima Taq DNA Polimerase nativa e de sua versão otimizada e mais processiva, para a exploração comercial no mercado nacional. Durante a fase I do projeto PIPE, a enzima Taq DNA Polimerase nativa foi obtida com alto rendimento e pureza, com sua atividade testada e as amostras qualificadas como livres de contaminantes microbianos, portanto, adequada para a segunda fase do projeto, enquanto que a enzima geneticamente manipulada e mais processiva já está em processo de produção para também ter a sua caracterização funcional e avaliação da qualidade das amostras. As etapas envolvidas neste projeto consistem em: i. aumento do volume de produção das enzimas de escala laboratorial para escala piloto e otimização de sua purificação; ii. caracterização bioquímica das enzimas produzidas e comparação com as demais polimerases disponíveis; iii. validação da estabilidade, integridade e reprodutibilidade do processo de produção em escala piloto; iv. estabelecimento de POPs (Procedimento Operacional Padrão) de produção e controle de qualidade, para assegurar a reprodutibilidade em todos os passos de produção. Para esta segunda fase, espera-se obter as enzimas com pureza superior a 95%, além de um produto inovador, como a enzima mais processiva, o que gera mais um produto comercialmente atratativo e com elevado valor agregado, além de serem produtos com crescente demanda em pesquisa. Propõe-se, portanto, contribuir para o processo de nacionalização da produção de reagentes básicos de biologia molecular, diminuindo custos e tempo de comercialização, fatores essenciais para o fortalecimento e competitividade da pesquisa no Brasil. (AU)