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Desenvolvimento do processo de produção de DNA polimerases com elevada qualidade e processividade

Resumo

As DNA polimerases são enzimas ubíquas capazes de sintetizar uma fita de DNA através da adição de desoxiribonucleotídeos a um DNA dupla fita iniciador, de acordo com um molde. É uma enzima amplamente empregada na manipulação in vitro do DNA, incluindo clonagem, sequenciamento e mutagêneses, entre outras técnicas. A DNA polimerase de Thermus aquaticus (Taq polimerase) é a enzima termoestável mais utilizada atualmente. Suas aplicações transcendem o uso em pesquisa, a exemplo do crescente emprego nas áreas de genotipagem e diagnóstica. Embora seja considerado um reagente básico para aplicações biotecnológicas, o mercado brasileiro é dependente de importações de DNA polimerases, obtendo-as com preços e prazos de entrega desfavoráveis. A Taq DNA polimerase recombinante, produzida em E. coli, apresenta características bioquímicas idênticas a proteína nativa de Thermus aquaticus com atividade, especificidade e termoestabilidade preservadas. A produção de Taq DNA polimerase recombinante é, portanto, possível e protocolos simplificados têm sido empregados em sua obtenção, especialmente, aqueles que exploram a sua natureza termoestável. No entanto, estudos recentes revelam a presença de DNA microbiano em várias preparações comerciais de DNA polimerases. Esta contaminação é um dos principais fatores limitantes do emprego da técnica de PCR para uso na detecção de DNA microbiano em amostras de ambiente ou de interesse médico. Adicionalmente, o aumento do desempenho das DNA polimerases é, frequentemente, alvo de projetos de engenharia de proteínas. O emprego de domínios proteicos fusionados tem apresentado resultados promissores na obtenção de polimerases com processividade elevada. Assim, este projeto busca o desenvolvimento do processo produtivo de Taq DNA polimerase capaz de aliar altos níveis de pureza e rendimento com a redução da contaminação com DNA microbiano. Adicionalmente, buscar-se-á a obtenção de uma enzima DNA polimerase quimérica, proveniente da fusão da Taq DNA polimerase com o domínio de ligação a DNA Sso7d, com elevada processividade reduzindo o tempo necessário para condução de reações de PCR rotineiras. As etapas envolvidas nesse processo consistem em: i. clonagem da construção fusionada da DNA polimerase de Thermus aquaticus e Sso7d de Sulfolobus solfataricus; ii. Estabelecimento do sistema de expressão heteróloga em bactéria; iii. Padronização do protocolo de produção e purificação da Taq e Sso7d-Taq; iv. Caracterização das atividades das enzimas produzidas comparadas às demais polimerases disponíveis comercialmente. O resultado esperado para esta fase é a obtenção da enzima Taq polimerase e de sua versão fusionada com alta processividade, na forma ativa e livre de contaminação por DNA microbiano. A viabilização desse processo produtivo e do novo produto permitirão a produção com escala compatível com a comercialização e o acesso do mercado nacional à enzimas de alta qualidade, com um preço mais atrativo do que suas equivalentes importadas, além do desenvolvimento de uma tecnologia inédita no Brasil. Propõe-se, portanto, contribuir para o processo de nacionalização da produção de reagentes básicos de biologia molecular, favorecendo o fortalecimento e competitividade da pesquisa desenvolvida no Brasil no cenário mundial. (AU)

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