Identificação e análise funcional de uma pseudo-cysteino protease identificada no transcriptoma do intestino médio de Sphenophorus levis

• Processo: 21/12995-3
• Modalidade de apoio: Auxílio à Pesquisa - Publicações científicas - Artigo
• Data de Início da vigência: 01 de dezembro de 2021
• Data de Término da vigência: 31 de maio de 2022
• Área do conhecimento: Ciências Biológicas - Bioquímica - Biologia Molecular
• Pesquisador responsável: Flavio Henrique da Silva
• Beneficiário: Flavio Henrique da Silva
• Instituição Sede: Centro de Ciências Biológicas e da Saúde (CCBS). Universidade Federal de São Carlos (UFSCAR). São Carlos , SP, Brasil
• Assunto(s): Transcriptoma
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Cysteine Protease | insect digestion | pseudoenzyme | transcriptome | Biologia Molecular de Insetos

Resumo

O Sphenophorus levis (Coleoptera, Curculionidae) é uma das principais pragas da cana-de-açúcar no Brasil. Embora suas principais proteases digestivas sejam conhecidas, seu complexo processo digestivo ainda precisa ser melhor compreendido. Nós construímos um transcriptoma a partir de RNA do intestino médio de larvas de 30 dias e identificamos sequências semelhantes à sua principal protease digestiva (cisteína catepsina Sl-CathL), no entanto, que apresentavam aminoácidos diferentes da cisteína no seu sítio ativo. Nós identificamos, produzimos de forma recombinante e caracterizamos a Sl-CathL-CS, uma pseudo cisteíno protease que possui a cisteina do sítio catalítico substituída por uma serina, e verificamos altos níveis de expressão gênica de seu transcrito no intestino médio de larvas de 30 dias de idade. Nós revertemos o resíduo de serina para cisteína e comparamos a atividade do mutante (Sl-CathL-mutSC) com Sl-CathLCS. Sl-CathL-CS não apresentou atividade de protease, mas Sl-CathL-mutSC hidrolisou Z-Phe-Arg-AMC (Vmax = 1017,60 ± 135,55, Km = 10,77 mM) e foi inibida por E-64, um inibidor clássico de cisteino proteases (Ki = 38,52 ± 1,20 µM), mas não por PMSF, um inibidor de serino protease. Além disso, Sl-CathL-CSinteragiu com uma cistatina de cana-de-açúcar, enquanto Sl-CathL-mutSC apresentou interação mais fraca. Finalmente, estudos de docking reforçaram as diferenças nos sítios catalíticos da proteína nativa e mutantes. Os resultados indicam que Sl-CathL-CS é uma pseudo-cisteíno protease que auxilia a digestão de proteínas, possivelmente interagindo com as cistatinas da cana-de-açúcar, permitindo que as verdadeiras proteases funcionem. (AU)