EMU científico: aquisição de sistemas integrados de transmissão e duplo feixe (iônico e varredura), para crio-microscopia eletrônica biológica de alta resolução por análise de partículas isoladas, tomografia in situ e difração de micro cristais

• Processo: 22/11403-8
• Modalidade de apoio: Auxílio à Pesquisa - Programa Infraestrutura - Científico
• Data de Início da vigência: 01 de agosto de 2023
• Data de Término da vigência: 31 de julho de 2030
• Área do conhecimento: Ciências Biológicas - Biofísica - Biofísica Molecular
• Pesquisador responsável: Glaucius Oliva
• Beneficiário: Glaucius Oliva
• Instituição Sede: Instituto de Física de São Carlos (IFSC). Universidade de São Paulo (USP). São Carlos , SP, Brasil
• Pesquisadores associados: Andre Luis Berteli Ambrosio ; Richard Charles Garratt ; Rodrigo Villares Portugal
• Assunto(s): Biologia estrutural Desenvolvimento de fármacos Proteínas Microscopia crioeletrônica Tomografia Aquisição de equipamentos Equipamentos multiusuários Infraestrutura de pesquisa
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Biologia Estrutural | Crio-microscopia eletrônica | desenvolvimento de fármacos | Estruturas de partículas biológicas isoladas | Proteinas | tomografia celular | Biologia Estrutural e Descoberta de Fármacos

Resumo

Propomos o estabelecimento de uma instalação de fronteira e inédita no Brasil, focada na seleção e caracterização de amostras biológicas para estudos estruturais de alta resolução por microscopia eletrônica criogênica (cryo-EM), que revolucionou a biologia estrutural última década. As implementações atuais de cryo-EM são análise de partículas únicas (SPA), tomografia (cryo-ET) e difração de micro cristais (micro-ED), fornecendo uma imagem completa dos processos biológicos de proteínas isoladas e seus complexos para ultraestruturas preservadas no contexto biológico nativo em células e tecidos. Para isso, selecionamos os equipamentos: (1) Tundra cryo-TEM (Thermo Scientific), que é um microscópio eletrônico de transmissão (TEM) de baixa tensão totalmente automatizado, com carregamento e descarregamento rápido de amostras, tomada de decisão auxiliada por inteligência artificial e coleta simplificada de dados de SPA; (2) Aquilos 2 cryo-FIB SEM (Thermo Scientific), que é um microscópio de duplo feixe - FIB (feixe focalizado de íons) e SEM (microscópio eletrônico de varredura) - dedicado à preparação de lamelas elétron-transparentes para cryo-ET - integrado à um microscópio de fluorescência (iFLM) para imagem correlativa de elétrons e luz (CLEM), que permitem a identificação e localização de regiões subcelulares de interesse. Aquilos 2 também permite a preparação, por afinamento nanométrico, de cristais para micro-ED. Além de expandir e acelerar nossas capacidades locais de pesquisa a níveis sem precedentes, o Tundra e o Aquilos 2 integrarão um centro multiusuário regional para preparação iterativa de espécimes cryo-EM no IFSC/USP, pioneiro no campo de cristalografia de raios X macromolecular na América Latina há mais de trinta anos. Proteínas, células e cristais recém-preparados serão vitrificados em grades com sistema Vitrobot Mark IV (Thermo Scientific), adquirido recentemente pelo CIBFar/CEPID (FAPESP.EMU 2022/04089-5). Tundra permitirá uma avaliação completa, otimização e coleta de dados preliminares para SPA e visualização qualitativa de lamelas finas e difração de micro cristais (ambos preparados no Aquilos 2), mas sem inclinação. Vale ressaltar que a troca de amostras dentro e fora dos microscópios em minutos, com feedback quase instantâneo, permite otimizar as condições da amostra de forma rápida e eficiente. Além de coletas de dados locais, para partículas grande e sem orientação preferencial, as melhores grades de amostras produzidas em nossa Instalação por usuários internos e externos, serão submetidas para aquisição de dados SPA, cryo-ET e micro-ED em plataformas mundiais de ponta que hospedam TEMs de 300 kV, como o Titan Krios, no Laboratório Nacional de Nanotecnologia (LNNano/CNPEM). O impacto da plataforma cryo-EM no IFSC/USP será amplo: entre outros, (1) constituirá um hub único no estado de São Paulo para usuários internos e externos de cryo-EM prepararem amostras adequadas e caracterizadas para estudos a alta resolução em microscópios eletrônicos de alta energia no Brasil (LNNano, Cenabio etc.) ou no exterior, (2) estimulará a aplicação rotineira de SPA, que já é um dos dois principais métodos para determinação de estruturas biológicas, com resolução atômica, juntamente com a cristalografia, (3) ajudará a superar os desafios na preparação da grade de amostras de proteínas intrinsecamente instáveis, que são propensas à degradação ou agregação e portanto sofrem durante a viagem até o centro de coleta de dados, (4) permitirá que a comunidade científica regional estude biologia estrutural de fronteira in situ por cryo-FIB SEM e CLEM, (5) oferecerá, por micro-ED, uma alternativa moderna e promissora à cristalografia de proteínas, tradicionalmente de raios X, (6) promoverá a ampla capacitação de estudantes e pesquisadores em técnicas de fronteira por meio de fácil acesso, treinamento e operação semanal integral e (7) potencializará a produtividade do Titan Krios, no LNNano. (AU)