Caracterização estrutural, funcional e triagem por fragmentos para Diidrofolato redutases de fungos patogênicos invasivos

• Processo: 24/22643-5
• Modalidade de apoio: Auxílio à Pesquisa - Regular
• Data de Início da vigência: 01 de junho de 2025
• Data de Término da vigência: 31 de maio de 2028
• Área do conhecimento: Ciências Biológicas - Microbiologia - Microbiologia Aplicada
• Pesquisador responsável: Marcio Vinicius Bertacine Dias
• Beneficiário: Marcio Vinicius Bertacine Dias
• Instituição Sede: Instituto de Ciências Biomédicas (ICB). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
• Município da Instituição Sede: São Paulo
• Pesquisadores associados: Kelly Ishida ; Rafaela Salgado Ferreira ; Roberto Parise Filho
• Bolsa(s) vinculada(s): 25/24805-5 - Aplicação de uma abordagem de desenvolvimento de fármacos baseado em fragmentos para a diidrofolato redutase de Candida auris, BP.IC; 25/15258-0 - Desenvolvimento e Manutenção de uma biblioteca de compostos para desenvolvimento de fármacos baseado em fragmentos, BP.TT; 25/13004-1 - Produção, cristalização e determinação de estruturas cristalográficas da Diidrofolato reductase de Cryptococcus neoformans, BP.IC
• Assunto(s): Terapia de alvo molecular Estrutura de proteína
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: alvos moleculares | antifolatos | desenvolvimento de fármacos baseado em fragmentos | Diidrofolato Redutase | estrutura de proteína | fungos patogênicos invasivos | bioquíimica de microorganismos

Resumo

As doenças infecciosas são um dos grandes problemas de saúde pública mundial e atual. Embora muito seja divulgado a respeito de infecções causas por bactérias, as doenças infecciosas causadas por fungos invasivos também são alarmante e levam a morte de um número elevado de pacientes, principalmente em ambientes hospitalares ou pessoas que sofrem de imunodeficiência. Além disso, há poucas alternativas de tratamento de infecções fúngicas invasivas, que são geralmente associadas a fortes efeitos colaterais, e há um crescente número de relatos de cepas resistentes aos antifúngicos utilizados. Assim, é urgente estudar alvos moleculares e também desenvolver novos antifúngicos para o controle dessas doenças, principalmente aquelas causadas por Aspergillus fumigatus, Paracoccidioides brasiliensis, Cryptococcus neoformans e Candida auris. Nesse projeto, temos como objetivo estudar a enzima diidrofolato redutase (DHFR) desses quatro fungos patogênicos. Esta enzima, que faz parta da biossíntese de tetraidrofolato (THF), é essencial para esses microrganismos, uma vez que esta coenzima é fundamental para biossíntese de DNA e alguns aminoácidos. Assim, pretenderemos determinar as estruturas tridimensionais e obter dados estruturais e funcionais sobre a interação dessas DHFRs com antifolatos. Também pretendemos aplicar da técnica de desenvolvimento de fármacos baseado em fragmentos visando a identificação de moléculas que apresentem novos arcabouços químicos que interagem com essas enzimas e levar a inibidores completamente novos para estes alvos. Para atingir nossos objetivos, realizaremos a expressão heteróloga das proteínas de interesse em sistema bacteriano, e realizaremos suas purificações por cromatografia de afinidade e exclusão molecular. As diferentes enzimas serão caracterizadas utilizando diferentes técnicas biofísicas e bioquímicas, incluindo cristalografia de proteínas, ensaio de thermal shift, calorimetria de titulação isotérmica (ITC) e ensaio de atividade pelo consumo de NADPH. Para a triagem de fragmentos, utilizaremos a técnica de thermal shift contra uma biblioteca de cerca de 600 moléculas presente em nosso laboratório. A validação ortogonal dos fragmentos será realizada por ressonância magnética nuclear (RMN), ITC e ensaio de consumo de NADPH. O modo de ligação das moléculas que forem validadas interagir com os alvos serão obtidos por cristalografia de proteínas. Com base nos fragmentos obtidos, estratégias de obtenção e compostos de maior afinidade serão aplicados, incluir SAR por catálogo, aplicação de métodos por inteligência artificial e síntese orgânica. Os melhores compostos obtidos serão testados frente aos diferentes fungos patogênicos, alvo deste projeto, para determinação dos efeitos in vivo e determinação de concentrações inibitórias mínimas. Ao final do projeto, esperamos obter informações cruciais sobre o modo de ligação e parâmetros de afinidade de antifolatos contra fungos patogênicos e também identificar moléculas que possam ser ponto de partida para o desenvolvimento de novos antifúngicos. (AU)