| Processo: | 04/02622-0 |
| Modalidade de apoio: | Auxílio à Pesquisa - Regular |
| Data de Início da vigência: | 01 de dezembro de 2004 |
| Data de Término da vigência: | 30 de novembro de 2009 |
| Área do conhecimento: | Ciências da Saúde - Medicina - Clínica Médica |
| Pesquisador responsável: | Luiz Fernando Onuchic |
| Beneficiário: | Luiz Fernando Onuchic |
| Instituição Sede: | Faculdade de Medicina (FM). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil |
| Assunto(s): | Expressão gênica diferencial |
| Palavra(s)-Chave do Pesquisador: | Expressao Diferencial | Gene Pkhd1 | Isoformas De Poliductina | Microarrays Dedicados |
Resumo
A doença renal policística autossômica recessiva (DRPAR) é uma forma hereditária e severa de doença renal cística que acomete os rins e o trato biliar. Todas as formas típicas da doença se devem a mutações num único locus, PKHD1. Este gene foi recentemente identificado por este pesquisador e colaboradores, que demonstraram tratar-se de um gene grande e associado a um complexo padrão de splicing. PKHD1 se estende por um segmento genômico superior a 469 kb e inclui um mínimo de 86 éxons, arranjados em múltiplos transcritos alternativos resultantes de variações de splicing. Se traduzidos, prevê-se que seus transcritos gerem isoformas associadas à membrana e solúveis. O quadro de leitura aberta mais longo do gene codifica poliductina, uma proteína putativa de 4.074 aminoácidos com um único domínio transmembrana e uma porção carboxi-terminal intracelular curta. Mais recentemente mostramos que poliductina se expressa em ramos do broto ureteral, ductos coletores renais e ductos biliares, um padrão consistente com as alterações anátomo-patológicas da doença. Mostramos também que o produto de PKHD1 se expressa no cílio apical primário de células epiteliais renais, constituindo-se em mais uma proteína relacionada a DRP expressa nessa organela. Sua expressão em membrana apical e citoplasma, contudo, sugere que além de sua provável participação na função ciliar, poliductina também desempenhe papéis funcionais em outros domínios subcelulares. Várias evidências sugerem fortemente que o complexo perfil de splicing de PKHD1 esteja intimamente associado às funções de seus múltiplos produtos potenciais. Entre elas, destacam-se a demonstração de um grande número de transcritos alternativos; a conservação do complexo padrão de splicing em seu ortólogo de camundongo, o gene Pkhd1; a confirmação de diferenças tecido e estrutura - especificas na expressão de transcritos; sua homologia a receptores de superfície celular da superfamília Sema e a D86, uma proteína secretaria; a existência de um perfil de transcrição e tradução potencial semelhante na família de genes das neurexinas; e, por fim, nossa recente detecção de três isoformas de poliductina com localizações subcelulares distintas, consistentes com a existência de proteínas de membrana e solúveis. A compreensão e a caracterização dos perfis de splicing de PKHD1 e Pkhdl, portanto, são provavelmente fundamentais à elucidação de seus papéis na organogênese renal e biliar e nos correspondentes tecidos maduros, e ao entendimento da patogênese da DRPAR. Neste projeto faremos uma análise global e integrada deste processo de splicing, um problema de difícil abordagem, utilizando tecnologias de microarrays que nos permitam investigar relações splicing-expressão-função. Nossa estratégia incluirá estudos subseqüentes baseados em phage display, de modo a permitir a integração transcrição-tradução. A construção de microarrays estratégicos, a preparação de cDNAs e de extratos proteicos a partir de tecidos humanos e` de tecidos de camundongo em diferentes estágios de desenvolvimento deverão esclarecer aspectos cruciais do mecanismo de splicing e caracterizar os perfis fundamentais de expressão diferencial gênica e protéica. Os transcritos e produtos traduzidos de maior expressão, por sua vez, serão confirmados por RT-PCR e western blot. Os resultados de expressão gênica e proteica de PKHD1 e de Pkhd1 serão constantemente integrados, de forma a permitir a proposição de um modelo básico funcional que envolva a ação integrada de diferentes isoformas. (AU)
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