Construcao de fago litico com promotor hsp70 e gene de gfp com potencial de aplicacao em testes de susceptibilidade a drogas para o genero mycobacterium ssp.

• Processo: 04/08405-0
• Modalidade de apoio: Auxílio à Pesquisa - Regular
• Data de Início da vigência: 01 de fevereiro de 2005
• Data de Término da vigência: 30 de abril de 2007
• Área do conhecimento: Ciências Biológicas - Microbiologia - Microbiologia Aplicada
• Pesquisador responsável: Mario Hiroyuki Hirata
• Beneficiário: Mario Hiroyuki Hirata
• Instituição Sede: Faculdade de Ciências Farmacêuticas (FCF). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
• Município da Instituição Sede: São Paulo
• Assunto(s): Mycobacterium tuberculosis Testes de sensibilidade microbiana
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Concentracao Inibitoria Minima | Fago D29 | Fago Recombinante | Mycobacterium Tuberculosis | Proteina Verde Fluorescente

Resumo

A tuberculose pulmonar é uma doença severa e tem sido agravada pela existência das cepas multi-drogas resistentes. Dentre os vários testes de sensibilidade, a concentração inibitória mínima (CIM) é um método de baixo custo que analisa várias amostras de isolados clínicos frente aos diferentes fármacos utilizados no tratamento da tuberculose. O presente projeto propõe a construção do micobacteriófago recombinante D29::gfp útil para ser empregado nos testes de CIM realizados em microplacas. Para a padronização desse ensaio, o fragmento correspondente ao promotor da hsp70-gfp clonado no pYL GFP será amplificado pela PCR (iniciadores sintetizados com sítios para Spe I). Numa segunda etapa, o DNA do fago D29 será extraído, digerido pela Spe I e incubado com o fragmento hsp70-gfp (amplificado pela PCR) sob a ação da DNA T4 ligase. O Gigapack III XL será utilizado para promover o encapsulamento in vitro do D29::gfp. Durante a determinação da CIM, os isolados clínicos resistentes aos fármacos após replicação lítica do D29::gfp expressarão a proteína verde fluorescente. (AU)