Abordagens de clonagem e análise funcional de um fragmento variável de cadeia única (scFv) anti-intimina

• Processo: 11/01245-1
• Modalidade de apoio: Auxílio à Pesquisa - Publicações científicas - Artigo
• Data de Início da vigência: 01 de março de 2011
• Data de Término da vigência: 31 de agosto de 2011
• Área do conhecimento: Ciências Biológicas - Microbiologia - Microbiologia Aplicada
• Pesquisador responsável: Roxane Maria Fontes Piazza
• Beneficiário: Roxane Maria Fontes Piazza
• Instituição Sede: Instituto Butantan. Secretaria da Saúde (São Paulo - Estado). São Paulo , SP, Brasil
• Assunto(s): Técnicas de diagnóstico molecular Análise funcional Anticorpos monoclonais Proteínas recombinantes Clonagem Publicações de divulgação científica Artigo científico
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Análise Funcional | anticorpo monoclonal | anticorpo recombinante | clonagem | diagnóstico | expressão | diagnóstico

Resumo

Intimina é um importante fator de virulência envolvido na patogênese de Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) e Escherichia coli enterohemorrágica (EHEC). Ambos ainda são considerados como importantes agentes causadores de diarreia em muitos paises em desenvolvimento e industrializados. Considerando que anticorpos são importantes ferramentas na detecção de vários patógenos, previamente nós obtivemos um anticorpo monoclonal IgG2b contra a região conservada (int388-667) da molécula de intimina. Por immunoblotting, este monoclonal mostrou uma excelente especificidade. Apesar do bom desempenho, este monoclonal não detectou alguns isolados de EPEC e EHEC que apresentam variações de aminoácidos na região 338-667 da molécula de intimina. Consequentemente, motivado pelo seu uso em diagnóstico, neste estudo nós clonamos e expressamos a fração variável de cadeia única deste anticorpo monoclonal (scFv). O RNAm do hibridoma anti-intimina foi extraído e reversamente transcrito para cDNA, as cadeias leves e pesadas da fração variável do anticorpo foram amplificadas usando iniciadores comerciais. As cadeias amplificadas foram clonadas em vetor pGEM-T Easy. Iniciadores específicos foram desenhados e utilizados na amplificação e na estratégia de ligação, obtendo assim o scFv, que foi em seguida clonado no vetor pAE. A cepa E. coli BL21(DE3)pLys foi transformada com o plasmideo pAE scFv-intimina e submetido a indução para expressão da proteína. O scFv anti-intimina foi expresso em corpúsculos de inclusão (fração insolúvel), o qual foi denaturado, purificado e submetido ao re-enovelamento. O rendimento protéico foi de 1 mg de proteína em 100 mL de cultivo bacteriano. Para testar a funcionalidade do scFv foram realizados ensaios de ELISA e imunofluorescência, demonstrando que 275 ng de scFv reagiu com 2 mg de intimina purificada, resultando em uma absorbância de 0.75 a 492 nm. O ensaio de imunofluorescência mostrou uma forte reatividade com EPEC E2348/69. Este estudo demonstrou que o anticorpo recombinante anti-intimina é capaz de reconhecer a região conservada da intimina (Int388-667) na forma purificada e cepa de EPEC. (AU)